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非洲猪瘟的流行病学、流行与防治 非洲猪疫情（asf）是由非洲猪疫情病毒（asfv）引起的急性、烈性和高度接触性传染病。ASF在1921年于非洲的肯尼亚发生，其后扩散到非洲各国及欧洲、南美洲。2007年以来，ASF在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。该病早期发现难、防控难、根除难，被称作养猪业的头号杀手，我国将其列为一类动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)规定的法定报告动物疫病。自从2018年ASF传入我国后，给养猪业造成巨大的损失。ASFV属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属成员，只有1个血清型，可分为24个基因型 1 材料和方法 1.1 病毒的血样、发酵 非洲猪瘟病毒Ⅱ型(ASFV Ⅱ型)基因组DNA,浓度0.73×10 非洲猪瘟病毒株来自广东省动物卫生监督所，是广州华医测检测科技有限公司2019年5月份参加广东省非洲猪瘟能力验证所留存样品，编号分别为A32、A193、A51、A99、A174,为含灭活病毒的血样。 猪瘟活疫苗，购自广东永顺生物制药有限公司；猪传染性胃肠炎灭活疫苗、猪流行性腹泻灭活疫苗，购自武汉科前生物股份有限公司；猪肺炎支原体活疫苗，购自齐鲁动物保健品有限公司；口蹄疫灭活疫苗，购自天康生物有限公司；猪圆环病毒2型灭活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，购自中牧实业股份有限公司。 Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0,购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒，购自天根生物科技有限公司；PEASY-T1 Simple Cloning Kit, 购自北京全式金生物技术有限公司； 荧光定量PCR仪(StepOne Plus),赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；凝胶成像系统(Tanon 1600)、电泳仪(EPS 300),上海天能科技有限公司产品。 1.2 方法 1.2.1 猪肺炎产物的核酸提取 采用Mini BEST Viral RNA /DNA Extraction Kit Ver.5.0,按照说明书进行操作，分别提取非洲猪瘟病毒(灭活)、猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪肺炎支原体的核酸，主要的提取过程是：取200 μL样品，加入200 μL的bufferVGB、20 μL的Proteinase K和1.0 μL的Carrier RNA,充分混匀，于56℃水浴温浴10 min。向裂解液中加入200 μL无水乙醇，充分吸打混匀。将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12 000 r/min离心2 min, 弃滤液。将500 μL的buffer RWA加入Spin Column中，12 000 r/min离心1 min, 弃滤液。将700 μL的buffer RWB加入Spin Column中，12 000 r/min离心1 min, 弃滤液。重复上一步骤。将Spin Column安置于Collection Tube上，12 000 r/min离心2 min。将Spin Column安置于新的1.5 mL RNase free collection tube上，在Spin Column膜的中央处加入30 μL～50 μL的RNase free dH 1.2.2 n/hlj/2018 根据非洲猪瘟病毒流行毒株Pig/CN/HLJ/2018(GenBank: MK333180.1)分别设计B646L(P72)和EP402R( 1.2.3 反应体系及程序 以p72-F、p72-R上、下游引物扩增，按照 以CD2v-F、CD2v-R上、下游引物扩增ASFV CD2v基因，反应体系如上。反应程序：预变性94℃ 4 min; 变性94℃ 30 s, 退火50℃ 30 s, 延伸72℃ 30 s, 35个循环；72℃ 延伸10 min。将扩增目的片段与PEASY-T1载体连接，转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，挑选阳性重组克隆，由上海生工生物工程有限公司测序鉴定。将正确插入 阳性质粒拷贝数的计算公式为：(6.02×10 1.2.4 2-定量实时荧光pcr检测方法的建立 1.2.4. 单次广泛化煌pcr反应条件的优化 用浓度为5.02×10 1.2.4. 2cd2v单次荧光定量pcr反应条件的优化 用浓度为7.7×10 1.2.4. p372-cd2v双重荧光定量pcr反应条件的优化 以浓度为5.02×10 1.2.4. 标准曲线的配置 分别对T1-p72和T1-CD2v阳性质粒进行10倍系列稀释，使其浓度范围分别为5.0