DB37T 1020-2008肉类制品中鸡肉、牛肉、猪肉和马肉成分PCR快速检测方法.pdf

ICS 67. 050X 04DB37山东省地方标准DB37/T1020—2008肉类制品中鸡肉、牛肉、猪肉和马肉成分PCR快速检测方法Detection for Chicken, Beef, Pork, Horse Ingredientof Meat Products by PCRMethod2008-XX-XX发布2008-09-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T言本标准由山东省质量技术监督局提出。本标准由山东食品标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业管理干部学院、山东省标准化研究院。本标准主要起草人：孙建霞、白卫滨、刘冠军、和法涛、许武强、郝征红。 DB37/T 1020—2008肉类制品中鸡肉、牛肉、猪肉和马肉成分PCR快速检测方法1范围本标准规定了肉类制品中鸡肉、牛肉、猪肉和马肉成分PCR检测方法本标准适用于鸡肉、牛肉、猪肉和马肉及其加工制品的PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.4-2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法3原理按照鸡肉、牛肉、猪肉和马肉特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。根据是否扩增获得预期的221bp，274bp，394bp和433bpDNA片段，判断试样中是否含有鸡肉、牛肉、猪肉和马肉成分·4试剂、材料及溶液配制除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T6682一级水要求。4. 1琼脂糖4.210mg/mL溴化乙锭（EB）溶液注：EB有致癌作用，配制和使用时应露一次性手套操作并要善处理反漫4.31U mO1/L (NaUH)溶液：称取Na0H80g，先用160mL水落解后，再加水定容到200mL(EDTANa,）溶液(pH 8.0)：称取 EDTANa:18.6 g，加入 70 mL加热至完全落解后，冷却至室温，用10o1/LNa0H落液调pH 至 8. (条件下灭菌20min.4. 5三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800nL水中，用浓盐酸调在103.4kPa（121）条件下灭菌20min。称取100g电泳级SDS落解于900mL水中，加热至68C助落，加入几滴浓盐酸调节溶液pH值到7.2,加水定容至1000mlL，分装备用，bmol/L NaLl:称取292.2gNaC1溶解于800mL水中，加水定容至1000mL，分装后灭菌备用包括 50mmo1/L TrisHC1 (pH8. 0), 5mmo1/L EDTANaz pH8. 0, 0. 1% SDS,临用时如入RNA酶（20mg/L)。4.9TE缓冲液 (pH 8.0):分别加入1o1/L TrisHC1 (pH 8. 0) 10 ml. 和 500 mmo1/L EDTANa, (pH8. 0)落液2mL，加水定容至1000ml在103.4kPa（121C）条件下灭菌20min4.1050XTAE缓冲液：称取242.2gTris，先用300mL水加热搅拌落解后，加100mlL（500mo1/L）EDTA-Na:溶液（pH8.0），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE4.11加样缓冲液：称取演酚蓝250mg，加水10nL，在室温下过夜溶解：再称取二甲基苯睛蓝250mg，用10mL水溶解；称取燕糖50g，用30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100ml，在4℃下保存.1 DB37/T1020—20084. 12DNA分子量标准。4. 13dNTPs：浓度为10mmo1/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸的等体积混合溶液。4. 14TaqDNA聚合酶（5U/μL）及PCR反应缓冲液。4. 15引物见表1。表1引物序列及扩增产物长度检测基因引物名称引物序列扩增长度ChickenCounonFgacctcccagctccatcaaacatctcatcttgatgaaa agat gaagaagaat gaggcg3221bpCattleCoumnonF-gacctcccagctccatcaaacatectcatettgat gaaa 3274bpComon-FCattle-R5tagaaaagtgtaagacccgtaatataag3PiggacctcccagctccatcaaacatctcatcttgatgaaaCattle-R5’ tagaaaagtgtaagacc