YC_T 365-2010烟草病毒的测定 逆转录-聚合酶链反应法.pdf

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ICS 65. 160X 85备案号:29841—2010中华人民共和国烟草行业标准YC/T 365—2010烟草病毒的测定逆转录-聚合酶链反应法Tobacco virus detection-Reverse transcription-polymerase chain reaction2010-10-15实施2010-10-11 发布国家烟草专卖局发布 YC/T 365--2010前言本标准按照 GB/T 1.1--2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家烟草专卖局提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会(SAC/TC144/SC2)归口。本标准起草单位:中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所。本标准主要起草人:颜培强、武常青、闫新甫、万秀清、乔婵、孙剑萍、郭兆奎、李丽杰、邱恩建、王春军、元野、刘德育、陈荣平、黄磊。 YC/T 365—2010附录C(资料性附录)RNA提取物的产量和纯度的测定方法C.1 紫外区波长扫描用经DEPC处理的超纯水将紫外分光光度计(6.2)调零,校正基线。移取10 μLRNA 提取液于比色皿中,加人1990μL经DEPC处理的超纯水,用移液器抽打混合液使之均匀,用紫外分光光度计在220nm~320nm波长范围扫描,记录260nm和280nm波长处样品的吸光值(OD)。C.2RNA提取物产量的计算根据260nm处的吸光值(OD)计算RNA提取物的产量,OD值为1相当于每毫升溶液中含有50 μg 的 RNA。C.3RNA提取物的纯度计算根据OD260/OD280的比值估算RNA提取物纯度,当比值为1.8~2.0时,RNA提取物纯度较好;当比值小于1.8或大于2.2时,需重新提取RNA。 YC/T 365—2010附 录 D(资料性附录)病毒RNA逆转录物2 μL;放入 PCR仪(6.1)中变性 10 min(70 ℃),取出 PCR管置于冰浴上 5 min;加人 5×M-MLV逆转录酶缓冲液(5.17)4 μL,10 mmol/L的 dNTPs(5.18)3 μL,40 U/μL 的核糖核酸酶抑制剂(5.19)0.5 μL,200 U/μL的 M-MLV逆转录酶(5.2)1μL,混合均匀;放人微量离心机(6.6)中室温离心10 s,转速为2000r/min;取出立即置于 PCR仪中,42℃条件下反应1h。10 YC/T 365—2010附录E(资料性附录)PCR反应体系及反应条件E. 1 PCR 反应液的配制在 0.5 μL 的 PCR 管中加人 10×PCR buffer(5.20)2.5 μL,加入 10 pmol/μL病毒病检测上下游特异性引物各1μuL,加人2.5 U/μL的DNA聚合酶(5.21)0.5μL,加人病毒 RNA反转录产物5μuL,加入超纯水 16μL。E.2PCR 扩增将配制好的 PCR反应液充分混匀,放人微量离心机(6.6)中离心10 s,转速为2 000 r/min;取出立即放人 PCR仪中;按表 E.1设置反应条件进行 PCR扩增。表E.1反应条件温度时间目的循环次数95℃5 min预变性194 ℃30 s变性各病毒的退火温度(见8.5)40 s退火3672 ℃30 s延伸72℃7 min终末延伸11 YC/T 365—2010附录F(资料性附录)扩增产物检测称1.500g琼脂糖(5.22)于100mL三角瓶中,加1×TBE电泳缓冲液(附录B的第B.1章)100mL,加热至琼脂糖完全熔解;加溴乙锭5μL,摇匀,冷却至 45℃后倒人已经放好梳子的胶模中,琼脂糖完全凝结后拔出样梳子;将凝胶放人已倒人1×TBE电泳缓冲液的电泳仪(6.3)中,取 10μL扩增产物加上样缓冲液0.5μL(附录 B的第B.2章),点样,并点人 DNA标准分子量;电泳电压为1V/cm~10 V/cm,待溴酚蓝(5.23)电泳到凝胶的中间位置时,停止电泳,取出凝胶,用紫外分析仪(6.4)观察电泳结果。12 YC/T 365—2010附录G(资料性附录)检测结果报告单No.送样单位送样人取样地点样品代号样品类型样品数量收样时间样品状态3种对照表现(是否正常)阳性对照:阴性对照:提取对照:提取物RNA纯度纯度:OD260 /OD280病毒名称PCR 鉴定引物电泳结果TMV-FTMVTMV-RCMV-F病毒检测CMVCMV-RPVY-FPVYPVY-RTEV-FTEVTEV-R备注结论检测人员签字技术负责人签字检测单位盖章检测时间:年月日13 中华人民共和国烟草行业标准烟草病毒的测定逆转录-聚合酶链反应法YC/T 365—2010中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:10004

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