DB37_T 3316-2018鸡J-亚群白血病实验室诊断技术.pdf

ICS65. 020. 30B45DB37山東东省地方标准DB37/T3316—2018鸡J-亚群白血病实验室诊断技术Laboratary Diagnostic Technique of Chicken Leukosis Virus Subgroup J (ALV-J)2018-06-12发布2018-07-12实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧善医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。本标准主要起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：成子强。I DB37/T 3316—2018鸡J-亚群白血病实验室诊断技术1范围本标准规定了我省针对ALV-J的检测诊断方法。本标准适用于判断鸡群是否患J亚群白血病。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1离白血病病毒J亚群AvianLeukosis VirusSubgroup J.ALV-JALV-J属反转录病毒科甲型反转录病毒属，是单股正链RNA病毒。ALV-J主要特点是引起多种禽类免疫抑制和髓细胞性白血病发生，对养鸡业威胁巨大。2. 2抗原/抗体检测通过标准的酶联免疫吸附实验（enzyme1inkedimmunosorbentassay，ELISA）检测ALV-J的抗原/抗体。应用指定的商品化ALV-J抗原/抗体检测试剂盒，用血清检测ALV-J抗体，用棉拭子检测ALV-J群特异性抗原（p27）具体实验步骤参照GB/T26436。抗体及p27均呈阳性，或二者之一呈阳性，可怀疑ALV-J感染。2. 3PCR聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)。2. 4RTPCR反转录-聚合酶链反应（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）。材料科与试剂3. 1常规使用的ELISA抗原/抗体检测试剂盒(IDEXX)。3.2常规使用的商品化的RNA提取试剂盒。3.3常规使用的商品化的RNA反转录试剂盒。3.4各检测方法所需的试剂。3.4.1PBS缓冲液见附录A中A.1.3. 4. 2灭菌水。 DB37/T 3316—20183.4.3蒸馏水3.4.4细胞生长塔养基见附录A中A.2.3. 4. 55细胞维持培养基见附永A中A.3。除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯4仪器与设备4.1全自动高温高压灭菌锅（温度范围：105-134℃：额定压力：0.23Mpa）。4.2低速离心机。4.3PCR 仪4. 4二氧化碳恒温细胞培养箱。4.5液氮储存罐。4.6研磨器。4.7手术剪。4.8各量程移液枪。4. 9超低温冰箱。4.10酶标仪。4. 11分光光度计5抽样5.1样品采集5.1.1组织样品的采集按1的比例，随机选取疑似亚群离白血病病鸡，用无菌手术剪分离肾脏、肝脏、脾脏等所需脏器100mg分装于1mL储存管内，并及时冻存于-80C冰箱或液氨罐内备用。5. 1. 2血液样品的采集用2.5mL无菌注射器于翅下静脉或颈静脉抽取1mL左右的静脉血，放入编号离心管内，倾斜静置，待血液分离出血清后吸取血清于编号的离心管内，储存于-20℃冰箱备用。5. 1. 3泄殖腔棉拭子的采集用无菌棉签插入殖腔内，擦拭后将棉签放入装有1mLPBS缓冲液的离心管内，储存于-20C冰箱备用。5.2样品运输与存放采集的样品应放入冻存管并放入冰盒内运输，然后上述要求及时放入液氮罐或-80℃冰箱或20‘C冰箱储存。操作方法6.1方法2 DB37/T 331620186.1.1抗原/抗体检测抗原/抗体检测是采用美国IDEXX公司的ELISA检测试剂盒检测。6.1.1.1样品处理检测样品前，棉拭子应反复冻融2次~3次，4℃，1006.2×g（3000转）离心2min～3min，吸取上清。血清样品于室温融化，500倍稀释，用于检测。6. 1.1. 2操作步骤按照试剂盒提供的检测步骤操作。6. 1.1. 3结果判定只要p27抗原和ALV-J抗体其中之一为阳性，需要进行下一步检测6. 1. 22RT-PCR检测通过对似病例组织RNA提取，反转承为cDNA作为模板进行特异性PCR检测，6.1.2.1RNA及cDNA提取将冻存于液氨罐内的组织用商品化试剂盒提取RNA，用分光光度计测浓度后用商品化试剂盒反转录成cDNA。RNA储存于-80‘C冰箱，cDNA储存于-20C冰箱。6. 1.2. 2操作步先完成RNA提取，具体操作按照试剂盒提供的步骤即可，测定浓度，然后将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用ALV-Jgp85片段的特异性扩增进行PCR扩增，扩增产物于120V电压，1%琼脂糖凝胶电泳检测。剩余的RNA保存于-80C冰箱，cDNA保存于-20C冰箱。具体反应条件见附录B