DB37_T 3113-2018猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测技术规范.pdf

ICS 65. 020. 30B 41DB37山長东省地國方标准DB37/T3113—2018猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测技术规范Antibodies Detection of Porcine Circovirus Type 2 with Colloidal GoldImmunochromatographic Assay2018-02-02发布2018-03-02实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 3113—2018前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：季俊、时建立、彭喆、吴晓燕、徐绍建、于江、孙文博、丛晓燕、朱晓琳、韩红、吴家强、杜以军、陈蕾、陈智、刘畅。I DB37/T 3113—2018猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测技术规范1范围本标准规定了猪圆环病毒2型（PorcineCircovirusType2，PcV2）的抗体胶体金试纸条制备方法及试纸条使用规范。本标准适用于猪圆环病毒2型的抗体快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语与定义下列术语与定义适用于本标准，3. 1PVC板聚氯乙烯板。3. 2BSA牛血清白蛋白。3. 3NC膜硝酸纤维素膜。3. 4PBS磷酸缓冲盐溶液。4材料及设备4. 1主要仪器设备4. 1. 1微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL）4. 1. 220000r/min低温高速离心机I DB37/T 3113—20184.1.3喷膜仪。4.1. 4切条机。4. 1. 5PVC 板.4. 1. 60.22μ无菌过滤器。4. 1. 7紫外分光光度计。4.1. 8电子天平精度为：0.001g。4. 2主要试剂或材料4. 2. 1BSA:配制见附录A.1。4. 2. 2氯金酸：配制见附录A.2.4. 2. 3NC 膜.4. 2. 4玻璃纤维膜。4. 2. 5吸水纸。4. 2. 6碳酸钾分析纯。4. 2. 7猪圆环病毒2型Cap蛋白。4. 2. 8羊抗兔IgG。4. 2. 91×PBS溶液(pH值7.4)：配制见附录A.3。4. 2. 10超纯水：符合GB/T6682，三级。4. 2. 110.1mo1/LTris-HCL:配制见附录A.4.4. 2. 12Tween-20分析纯。4. 2. 13聚酯纤维膜。5免疫胶体金试纸条的制备5. 1胶体金的制备所有试剂均需提前经0.22口无菌滤器滤过。5.1.1用电炉加热99ml超纯水至沸。5.1.2加入1mL1%氯金酸溶液，继续加热3min。5. 1. 3再缓慢加入2叫1%柠檬酸钠溶液，边加入边用磁力搅择器进行搅拌。5.1. 4继续加热，颜色由灰色变为黑色，继而变为亮红色停止加热（约5min）5. 1. 5避光室温冷却后，用超纯水补足至100mL。5. 1. 6用紫外分光光度计分别测其在520nm和535nm处的吸光度值，使其吸光度值在0.8~1.0之间即可。5. 2胶体金标记抗原和标记pH值用0.2mo1/L碳酸钾将胶体金溶液调节pH值为8.0后，加入纯化后的猪圆环病毒Cap蛋白，使其终浓度为10μg/mL。5.3金标抗原的封闭和纯化5.3.1在金标溶液中加入羊抗免（IgG），使其终浓度为1g/mL。5. 3. 22加入1/10体积的10%BSA溶液（终浓度1%为封闭液）封闭，混勾并静置15min.5. 3. 34C，8000 r/min离心20 min弃上清，2 DB37/T 3113—20185.3.4用原体积1/20且含有10%蔗糖的0.1mo1/LTris-HCL(pH值8.5)储存液重新悬浮沉淀，5.4玻璃纤维膜、聚酯纤维膜与NC膜的预处理5.4.1聚酯纤维膜（金标结合垫）用Tween-20，37C浸泡30min。5.4.2玻璃纤维膜（样品垫）、NC膜用封闭液37C没泡30min。5.4.3用1×PBS落液(pH值7.4)分别对金标结合垫、样品垫和NC膜洗3次，37C干燥备用，5.5喷膜5.5.1用喷膜仪将标记Cap蛋白的胶体金以5μL/cm的喷涂量喷涂到金标结合垫上，37℃C干燥备用NC膜的检测线（T-线）上，37C干燥备用。5.5.3将羊抗兔（IgG）稀释到1mg/mL，用喷膜仪按1μL/cm的喷涂量喷涂到NC膜的对照线（C-线）上，37干燥备用。5.6免疫胶体金试纸条的组装5.6.1将处理好的样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水纸（吸水垫）从上到下粘贴在预先裁好