DB37_T 4058-2020水生动物细菌性病原检测技术规范.pdf

ICS 65. 150B 50DB37山長东省地方标准DB37/T4058—2020水生动物细菌性病原检测技术规范Inspection protocol for bacterial pathogens of aquatic animals2020-07-09发布2020-08-09实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 4058—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省渔业标准化委员会（鲁TC03）归口。本标准起草单位：威海海洋职业学院、山东省渔业技术推广站、中国科学院水生生物研究所、江苏省渔业技术推广中心、威海市渔业技术推广站。本标准主要起草人：侯仕营、刘朋、刘晓燕、李爱华、董济军、刘绩延、吴亚锋、马湘君、尹相菌、刘振华， DB37/T 4058—2020水生动物细菌性病原检测技术规范1范围本标准规定了水生动物细菌性病原（Bacterialpathogensof aquatic aninals）检测的试剂与材科、仪器设备、采样、细菌性病原分离培养和病原菌检测。本标准适用于山东省水生动物常见细菌性病原检测，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求SC/T7014—2006水生动物检疫实验技术规范SC/T 7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术SN/T 2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3试剂与材料试剂与材料应符合GB4789.28和附录A的规定。4仅器设备按照SC/T7201.1的规定执行。5采样5.1采样用具应使用无菌采样用具。5.2采样数量、个体要求、采集部位按照SC/T7014—2006中第6章的规定执行。5.3样品运输及保存按照SN/T2123的规定执行。6细菌性病原分离培养6.1分离培养 DB37/T 4058—20206.1.1兼性厌氧菌和需氧菌的分离培养规范取样后，采用稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法等方式，在28℃～30℃培养24h；低温下取样应在15℃～18C同步培养24h。6.1.2厌氧菌的分离培养将处理好的平板置于玻璃干燥器，并在其上方放置连二亚硫酸钠和无水碳酸钠（分别研细均匀，临用前混合置于一平皿内）各30g/1000mL容积，然后将干燥器盖严，用凡士林密封，在28℃～30℃培养24h：低温下取样则应在15C~18℃C同步增养24h。严格庆氧菌的分离培养应在庆氧工作台中进行。6.2纯培养6.2.13兼性厌氧菌和需氧菌的纯培养挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.1的方法培养，6.2.2厌氧菌的纯培养挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.2的方法培养，6.3多次纯培养若经过纯培养后，未能得到形态特征基本一致的单菌落，可进行多次纯培养，直到获得形态特征基本一致的单菌落，操作步骤应符合6.2的要求。病原菌检测7.1病原菌16SrDNA序列分析7.1.1菌落PCR按照附录B执行。7.1.2结果判定7. 1. 2. 1PCR结果可靠DNAMarker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照可见1472bp左右DNA条带，且阴性和空白对照样品无条带出现，则PCR实验结果可靠，可进行样品分析。7. 1. 2. 22电泳失败DNAMarker标准样品未出现条带，则电泳失败，应检查电泳试剂重新进行电泳。7. 1. 2. 3检测结果无效DNAMarker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照无条带或者DNA条带非1472bp左右，或者在阴性对照和空白对照样品中出现了DNA条带，则试验结果无效，应重新进行PCR扩增。7.1.3克隆、测序和比对2 DB37/T 4058—2020将7.1.2样品扩增条带克隆、测序，序列输入到NCBI网站进行比对，确定细菌的属种。7. 2病原菌生化特性检测按照SC/T7014—2006中的9.4规定执行。7. 3结果综合判定需要鉴定病原菌到属依据7.1.3结果进行判定，需要进一步鉴定到种应结合7.2结果进行综合判定。3 DB37/T 4058—2020附录A（规范性附录）试剂的配制A.1TE缓冲液A. 1. 1A液: 1 mo1 /L Tris · HCI (pH8. 0)称取Tris碱6.06g，加去离子水40mL落解，滴加浓HC1约2mL调pH至8.0，定容至50mL。A. 1.2B液: 0. 5 mo1/L EDTA (pHB. 0)称取Na,EDTA·2H:09.31g，加