NY_T 4027-2021CNI群禽腺病毒检测方法.pdf

ICS 11.220CCS B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 4027—2021■群禽腺病毒检测方法Diagnostic methods for group I fowl adeonvirus2021-12-15发布2022-06-01实施中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 4027—2021目次前言引言.范围，规范性引用文件术语和定义缩略语临床诊断5. 1流行病学5. 2临床症状5. 3病理变化5. 4结果判定PCR检测6. 1仪器设备和耗材6. 2试剂6.3操作方法6. 4结果判定荧光PCR检测.7. 1仪器设备和耗材7. 2试剂..7. 3操作方法7. 4结果判定IFA鉴定8. 1仪器设备和耗材8. 2试剂8. 3操作方法8. 4结果判定病毒分离培养9. 1仪器设备和耗材9. 2试剂9. 3细胞和鸡胚9. 4操作方法9. 5结果判定10综合判定附录A(资料性)溶液配制附录B资料性）PCR检测引物及判定标准图例附录C(资料性)阳性对照病毒附录D(资料性)荧光PCR检测引物及判定标准图例附录E(资料性)IFA鉴定使用单克隆抗体及判定标准图例附录F(规范性）细胞培养 NY/T 4027—2021附录A（资料性）溶液配制A.1磷酸盐缓冲液(PBS)的配制称取8.0g氟化钠(NaCI)、1.44g磷酸氢二钠(NaHPO,·12HzO)、0.24g磺酸二氢钾(KH,PO,)、0.2g氯化钾(KCI)报次序落于900mL双蒸水中，混匀，调pH至7.4，加双蒸水将落液定容至1L，高压消毒灭菌112kPa30min，保存于2C~8C。A.2组织研磨液的配制在99mLPBS中加人1mL青霉索-链霉素溶液(其中，青霉素浓度为10000U/mL，链霉素浓度为10mg/mL)，混匀，保存于2C~8C。A.3TAE缓冲液的配制称取242gTris、37.2gNa;EDTA·2H;O按次序溶于900mL双蒸水中，加入57.1mL的酷酸搅拌，加双蒸水将溶液定容至1L配制成50XTAE缓冲液，室溢保存，使用时，取50XTAE缓冲液2mL，加人98mL双蒸水，配制成100mL1×TAE缓冲液，A.41%琼脂糖凝胶的配制量取100mL1XTAE缓冲液，加人三角瓷瓶，加人1g琼脂糖，加热充分溶解，当温度降低至约50℃，加入10μLEB或EB替代物，混勾后倒入制胶模具内，插人齿梳，等待凝胶凝固。A.5细胞封闭液的配制称取0.1gBSA溶于10mLPBS中，混匀，配制成1%BSA的细胞封闭液，A.6细胞培养液的配制在89mLDMEM培养基中加人10mLFBS和1mL青霉素-链霉素溶液（其中，青霉素浓度为10000U/mL，链每素浓度为10mg/mL)，混匀，保存于2C8C。A.7细胞维持液的配制在97mLDMEM培养基中加人2mLFBS和1mL青霉素-链霉素溶液（其中，青霉素浓度为10000U/mL,链霉素浓度为10mg/mL)，混匀保存于2C~8C。7 NY/T录B(资料性）PCR检测引物及判定标准图例B.1 FAdV-I PCR检测引物见表B.1.表B.1FAdV-PCR检测引物目的片段引物名称5-3的序列在HLJFAd15毒株基因组中的位置产物大小Hezon 基FAdV-I FGCCACCGGAAGCTACTTTGA20 473~20 492FAdV- I RTTGTGATCCATGGGCATGA22 109~22 1271 655 bpB. 2引物的弱释新合成引物短暂离心(12000r/min，30s)；用DEPC处理的灭菌双蒸水溶解，充分混勾，配置成浓度为100μmol/L的储存液，一20C保存；使用时，将储存液用DEPC处理的双蒸水进行10倍稀释，配置成浓度为10μmol/L的引物，一20C保存。B.3PCR检测判定标准图例见图B.1.p2 0001 000750500250100标引序号说明，MMarker;FAdV-I 性样晶B-FAdV-I R性样晶图 B. 1FAdV-1PCR检测判定标准图例 NY/T 4027—2021附录C(资料性)阳性对照病毒FAdV-4阳性对照HLJFAd15毒株，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病创新团队于2015年从黑龙江省肇东市发病蛋鸡肝脏分离并鉴定保存，全基因组Genbank登录号为KU991797。如有需要，可由毒株保存单位提供或惠赠。阳性对照为病毒接种LMH细脑72h后收获，冻融3次，将离心收集的上清液分装，一80℃保存，9 NY/T 4027—2021附录D(资料性)荧光PCR检测引物及判定标准图例D. 1FAdV-I荧光PCR检测引物见表D.1,表 D. 1FAdV-I荧光PCR检测引物目的片段引物名称5° - 3的序列产特大小Hezon 基因F