DB37T 609-2006猪肉中盐酸克伦特罗残留量的测定 酶联免疫吸附法.pdf

ICS 67.120.10B40DB37备案号山長东省地電方标准DB37/T609—2006猪肉中盐酸克伦特罗残留量的测定酶联免疫吸附法Determination of clenbuterol hydrochloride in porkenzyme linked immuneosorbent assay200×-××-××发布2006-07-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37 /T609—2006前言本标准由山东省备牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出，本标准起草单位：山东省畜产品质量检测中心。本标准主要起草人：高迎春、陈玲、冯修光、魏秀丽 DB37 /T609—2006猪肉中盐酸克伦特罗残留量的测定酶联免疫吸附法1范围本标准规定了猪肉中盐酸克伦特罗的酵联免疫吸附测定方法。本标准适用于猪肉中盐酸克伦特罗的快速检测．本方法检测限为1g/kg。该方法适合于对试样的筛选，检测结果阳性者，需进一步用其他方法确证。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中残留的克伦特罗经盐酸提取，用磷酸二氢钾和氢氧化钠沉淀蛋白，C柱净化后供酶联免疫测定法测定。酵联板的微孔包被有羊抗免的抗体，加入免抗克仑特罗特异性抗体，两者结合而被同定。标样或试样中克仑特罗与标抗原竞争免抗克仑特罗特异性抗体.通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原。加入底物，结合到酶联板上的酶标记物将底物转化为有色产物，于酵标仪测定其吸收度，用标准曲线计算。2材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水为蒸馏水，符合GB/T6682三级水的规定。2. 1盐酸(HC1)2.2无水甲醇(CH0H)2.3氢氧化钠(NaOH)2. 4磷酸二氢钾(KH,PO,)2.5磷酸(HbPO.)2.6盐酸溶液［（HC1））=0.42%：取盐酸4.2ml，加水至1000ml。2.7磷酸二氢钾溶液c【（KH,P0,）】=0.5moL/L：取磷酸二氢钾68g，如水800mL溶解并用磷酸调pH值至3.0，用水稀释至1000mL4.8磷酸二氢钾落液c【（KH,PO,）】=0.05moL/L：取磷酸二氢钾6.8g，加水800mL落解并用磷酸调pH值至3.0，用水稀释至1000mL。4.9氢氧化钠溶液β【（NaOH）】1=4%：取氢氧化钠4g，如水使溶解成100mL。4. 10盐酸克伦特罗系列标准溶液4. 11抗体浓缩液4. 12缓冲溶液1 DB37 /T609—20064. 13酶标记抗原4. 14底物4. 15底物缓冲液4.16终止液4. 17盖板膜3器3. 1分析天平：感量0.01g3. 2勾浆机3. 3酵标板3. 4冷冻离心机（10000r/min）3. 5微量移液器：单道1μL100μL：多道50μl250μL3. 6振荡器3.7凝涡振荡器5.8微型振荡器5.9酵标仪4测定步骤使用不同品牌试剂盒时，试样的提取方法和测试程序可根据试剂盒说明书略作调整。4.1试料的提取取猪肉样品约20g，以10000r/min匀浆2min，称取1g匀浆物（精确至0.01g），置50mL离心管中，加盐酸溶液（4.6）5.0mL，于振荡器上震荡1.5h，在10℃C-15℃C以4000r／min离心15min，上清液移入另一50ml离心管中，加入氢氧化钠溶液（4.9）300μL，混，震荡15min，加入0.5moL／L磷酸二氢钾溶液（4.7）4.0mL，混匀，2℃-8℃放置过夜，取上述溶液于10℃～15℃以4000r／min离心15min，上清液备用。Cs固相萃取柱依次用无水甲醇3mL，0.05moL/L磷酸二氢钾溶液（4.8）2mlL预洗，不使柱床干，将备用上清液全部过柱，用0.05moL／L磷酸二氢钾溶液（4.9）2mL淋洗，弃去所有淋洗液，用无水甲醇（4.2）2.0ml洗脱，收集洗脱液，于50C~60C用氮气或空气缓慢吹干，残余物用水1.0mL落解，以4000r/min以上的速度离心15min，上清液作为试样溶液供酵联免疫测定法测定4.2测试程序4.2.1取出酶标板（5.3）及所有试剂，使试剂盒温度升至室温。4.2.2加入用缓冲溶液（4.12)100倍稀释的抗体（4.11）100μL,封口膜封板，室温孵育30分钟。4.2.3倒出孔内波体，将酶标板（5.3）倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体.用多道移波器加水250L到酶联板的微孔内，然后倒出孔内液体，如此重复操作三次。4.2.4分别吸取系列标准落液（4.10），空白试料落液