荧光定量PCR技术研究进展及其在植物遗传育种中的应用.pdfVIP

荧光定量 PCR 技术研究进展及其在植物遗传育种中的应用 王甜;陈庆富 【摘要】荧光定量 PCR(Fluorescence in Quantitative PCR,FQPCR)技术是 20 世纪 90 年代发展起来的一种新的核酸定量技术,具有高准确性、高特异性等特点, 在生物科学和医学研究中发挥着极大的作用.本文综述了荧光定量 PCR 技术的原理、 荧光探针类型及其在植物遗传育种中应用. 【期刊名称】《种子》 【年(卷),期】2007(026)002 【总页数】6 页(P56-61) 【关键词】荧光定量 PCR;FRET;荧光探针 【作者】王甜;陈庆富 【作者单位】贵州师范大学生物技术与工程学院植物遗传育种研究所,贵阳,550001; 贵州师范大学生物技术与工程学院植物遗传育种研究所,贵阳,550001 【正文语种】中 文 【中图分类】S5/59|03| 自 1985 年，美国 Perkin-Elmer Cetus 公司人类遗传研究室 Mullis 等人发明了具 有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ，PCR) ，使人们梦寐 以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实［1 ］。近年来，许多研究人员根据 自身研究需要 ，在常规 PCR 技术的基础上 ，对经典的 PCR 技术进行了大量改进 ， 进而衍生出多种新型的 PCR 技术，例如 ，免疫-PCR(Immune-PCR)、巢式引物 PCR(Nested primer PCR)、反转录 PCR(Reverse transcription PCR ，简称RT)、 反向 PCR(Reverse PCR)、荧光定量 PCR(Fluorescence in Quantitative PCR ， FQ-PCR)等十多种类型［2 ］。 荧光定量 PCR(FQ-PCR)最早是在 1992 年由日本人 R ．Higuchi 提出的［3 ］。他 的基本思想是利用荧光染料 EB(溴化乙锭)可以插入到双链核酸中受激发光的性质， 在 PCR 反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB 的含量就能实时监控 PCR 反应的进程，根据 PCR 反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品 的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。但Higuchi 利用的是嵌 入荧光染料检测，它只能简单地反映 PCR 反应体系中总的核酸量，是一种非特异 性的检测方法。 直到 1995 年，美国 PE 公司研制成功具有革命性意义的荧光定量 PCR 技术 ，融合 了 PCR 高灵敏性、 DNA 杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点 ，直接探 测 PCR 过程中荧光信号的变化，以获得特定区段扩增产物定量的结果 ，不需要 PCR 后处理或电泳检测，完全闭管操作(整个过程中仅有加入样品的一次开盖) ，一 举克服了常规 PCR 技术的诸多难题。而荧光定量 PCR 技术真正进入市场化则是美 国 ABI 公司在 1996 年推出了第一台荧光定量 PCR 仪 ，使得荧光定量 PCR 得以广 泛应用［4 ］。 荧光定量 PCR 技术是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团 ，利用荧光信号积累实时 监测整个 PCR 进程的方法。它可以从复杂的样品中检测出微量的目标核酸，具有 高准确性、高特异性，即使是检测单分子也具有很高的敏感性。现在这门技术已经 渗透到所有的分子学科和诊断应用，在生物科学研究和医学研究中发挥着极大的作 用［5 ］。 荧光定量 PCR 检测时，在普通 PCR 的基础上加入的荧光化合物可分为非特异性的 嵌入荧光染料及特异性荧光(引物)探针两大类型。前者是利用嵌入荧光染料检测， 只是简单地反映 PCR 反应体系中总的核酸量，是一种非特异性的检测方法。后者 由于增加了探针的识别步骤，特异性、专一性更高。二者各有优缺点，在不同的研 究目的中被应用［6 ］。 它们的基本原理是:扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本 DNA 含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物 (荧 光探针)与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的 检测就可以测定样本核酸量［7 ］。 1 ．1 非特异性荧光定量 PCR 非特异性荧光定量 PCR 主要是利用嵌入式荧光染料(如 EB、YO-PRO、YOYO、 SYBR Green 等)与双链 DNA 结合发光的特性来指示扩增产物的增加量［ 8 ］。例 如，SYBR GreenⅠ只与 DNA 双链结合，插入 DNA 双链时荧光信号显著增强;当 DNA 变性