DB37T 420.2-2004海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程 第2部分:扫描电镜诊断法.pdf

ICS 65.150B 51DB37山东省地國方标准DB37/T 420.2-2004海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程第二部分：扫描电镜诊断法2004-12-14发布2005-01-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 420.2-2004前 言本标准由山东省海洋与渔业厅提出本标准由山东省渔业标准化专业技术委员会归口，本标准起草单位：山东省海水养殖研究所。本标准起草人：李天保、叶海斌、刘恩孚、朱安成、吴志宏。 DB37/T 420.2-2004海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程第二部分：扫描电镜诊断法1范围本标准规定了指状拟舟虫病扫描电镜诊断所需试剂与材料、操作步骤和结果判定。本标准适用于海水养殖鱼类，包括牙鲆、大菱鲆、真鲷等养殖鱼类品种，感染指状拟舟虫情况的筛选和诊断。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-92《分析实验室用水规格和实验方法》。3指状拟舟虫病的病理学特性指状拟舟虫是海水鱼类养殖过程中引发寄生虫疾病的主要寄生虫之一。感染指状拟舟虫可导致鱼类肌肉组织及脑组织严重病变、坏死，并大量寄生于循环系统中春噬血细胞，导致贫血，感染初期，在鱼的体表以及口腔粘膜等处发生溃烂，严重时侵入鱼体内，常维发感染致病性细菌导致鱼类死亡率增高。试剂和材料若非注明，本标准使用确认为分析纯的试剂。所用水若非注明应符合GB/T6682-92规定。NazHPO,*2H:0 .NaH,PO,*2H,0.戊二醛.30%乙醇。50%乙醇。70%乙醇。80%乙醇。90%乙醇。无水乙醇。过滤海水：盐度为2030的海水在室内放置一周后，经滤纸和0.22μ滤膜过滤。磷酸盐缓冲液按附永A的规定。磷酸缓冲戊二醛按附求A的规定，5检验步骤用过滤海水清洗病鱼溃烂组织，收集清洗液，离心（2000r/min，5min），用过滤海水反复洗涤沉淀物。将洗涤后的沉淀物放入用磷酸盐缓冲液（0.1mo1/L，pH7.2）配制的1%戊二醛中固定20min～30min，沉淀物数次，在30%、50%、70%、80%、90%、100%梯度乙醇脱水处理各5min，各级离心均为1000r/min，- DB37/T 420.2-2004收集虫体，将含有无水乙醇的虫体滴于载玻片上，临界点干燥仪干燥、离子溅射仪喷金后于扫描电镜下观察。6结果判定指状拟舟虫体动基列约为20列～22列，口区开阔，长可超过体长的一半，日区内3片小膜，位于虫体近顶端小膜1(M)呈短小的短三角形，约由10多个毛基粒组成，小膜2(M）长约14μm～16μm，为相互平行的3排纵行的毛基粒列，含有儿个毛基粒。口侧膜（PM）起始于M中部，自M中部至M前端为一单列毛基粒，后变为“之”形的双动基列构造，并绕行至胞口（Cs）后。盾片（Sc）呈倒三角形，由多对毛基粒组成。虫体尾端为多个毛基粒构成的尾毛多复合体（CCo），单一尾毛由此发出，大核（a）、小核（Mi）各一个，位于虫体中部。大核为不规则椭圆形，小核近球形，位于大核上方。M,MaMaPMCsScCCo20ja图1指状拟舟虫纤毛及核器模式图（左腹面观，右背面观）2 DB37/T 420.2-2004附录（规范性附录）试剂配方磷酸盐缓冲液甲液：Na,HP0,*2H,035. 61g用蒸馏水定容至1000ml.乙液：NaH,P0,*2H:027. 60g用蒸馏水定容至1000ml。分别量取甲液和乙液36.0ml、14.0ml，混合后即为0.2M磷酸盐缓冲液A. 21%磷酸缓冲戊二醛固定液0.2M磷酸盐缓冲液50ml25%戊二醛水溶液4ml上述两溶液混合后，用双蒸水补充至100ml.3