DB37_T 3128.1-2018I群禽腺病毒感染诊断技术 第1部分：病毒分离鉴定.pdf

ICS65. 020. 30B41DB37山長东省地電方标准DB37/T3128.1—2018群禽腺病毒感染诊断技术第1部分：病毒分离鉴定Diagnostic techniques for Fowl Adenovirus Group I infectionPart 1 : Isolation and identification of FAdV group I2018-02-02发布2018-03-02实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 3128. 1—2018前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、窦砚国、郑肖强。I DB37/T 3128.1—20181群禽腺病毒感染诊断技术第1部分：病毒分离鉴定1范围本标准规定了I群禽腺病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。本标准中群离腺病毒分离与鉴定技术适用于1群离腺病毒中12种血清型病毒的分离鉴定、间接免投荧光试验（IFA）适用于上述病毒的检测、限制性片段长度多态性分析（RFLP）适用于对I群禽腺病毒12种血清型病毒的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定义下列定义和术语适用于本文件。3. 1I群禽腺病毒Fowl adenovirus group1是引起家禽包涵体肝炎和肝炎-心包积液综合征的病原，基于交叉中和试验结果，该病毒可分为12种血清型。3. 2间接免疫荧光试验Indirect immunofluorescence assay(IFA)用对应某一种抗原的抗体(这里被称为一抗)与细胞孵育结合，在采用对应一抗(也就是抗一抗)的抗体(这里被称为二抗，二抗上偶联有荧光素分子)与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光信号为阳性反应。3. 3限制性片段长度多态性分析RestrictionFragmentLengthPolymorphism（(RFLP）利用限制性内切酵能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，用于检测DNA序列多态性，3. 4LMH细胞 DB37/T 3128. 1—2018鸡胚肝癌上皮细胞系，来源于雄性鸡肝脏肿瘤。4实验室质量控制4.1实验室符合GB19489和GB/T27401要求，实验室必须为生物安全ⅡI级（BSL-2级）及以上实验室4.1.1操作中注意事项4.1.1.1从事PCR工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，尽可能形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。4.1.1.2特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染4.1.1.3病毒分离区域的鸡胚接种操作区和细胞增养操作区也应遵循一定的布局原则，避免交文污染4.1.2注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过适当的方式（如樊烧、或送有资质的医用垃圾处理公司）进行无害化处理，4.1.3生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做最终处理。4.2人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术。4.3仪器设备a) 生物安全柜：b)PCR 仪:c)CO,恒温培养箱（37℃恒温）：d)台式低温高速离心机（最大转速12000r/min）：e)电泳仪：f)电泳槽：g)紫外凝胶成像仪：h) 2°C~8° C 冰箱:i)20°C冰柜;j)微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL），带滤芯的枪头：k)孵化器（37℃恒温）；1)水平摇床：m) 电子天平精度为：0.001g：n)电磁炉或微波炉；o) 荧光倒置显微镜（FITC）。4. 4试剂和材料除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。a)磷酸盐缓冲液（pH=7.0~7.4），见A.1:b)细胞培养液（含10%血清的DMEM培养基）：细胞维持液（含1%血清的DMEM培养基）：甲醇：丙酮（1:1）固定液；e)抗体稀释液PBST，见A.2：2 DB37/T 3128.1—2018f)商品化的FITC标记鼠抗兔荧光抗体：g) 免抗I群禽腺病毒多克隆抗体（灭活疫苗免疫免制备）：h