DB23-T1243-2008黄瓜分子聚合育种技术规程.pdf

ICS65.020.99B21DB23备案号：黑龙江省地方标准DB23/T网—200%黄瓜分子聚合育种技术规程实施200%-叉发布黑龙江省质量技术监督局发布 DB23/T ××××—2007前言本标准由黑龙江省农业委员会提出。本标准由黑龙江省农业标推化技术委员会归口。本标准起草单位：东北农业大学园艺学院。本标准主要起草人：秦智伟、王桂玲、周秀艳、张艳菊、王新国。本标准附录A、B为规范性附录。本标准为首次发布。 DB23/T ××××—2007黄瓜分子聚合育种技术规程1范围本标准规定了黄瓜分子聚合育种技术的定义、仪器、试剂、目的基因的标记、分子聚合技术。本标准适用于黄瓜分子聚合育种。2 定义分子聚合育种含有多个目标基因的单株，从中再选出农艺性状优良的单株，实现有利基因的聚合。3仪器3.1 PCR仪3.2低温高速离心机3.3稳压稳流电泳仪、垂直板电泳系统3.4常温、低温冰箱3.5紫外凝胶成像系统3.6微量移液器4 试剂4.1常规试剂4.1.1DNA提取缓冲液，见附录 A14.1.26%聚丙烯酰胺凝胶，见附录A24.1.310XTBE缓冲液贮液，见附录A34.1.45×TBE溶液，见附录A44.1.5载样缓冲液，见附录A54.1.6过硫酸铵贮液，见附录A64.1.7硝酸银溶液，见附录A74.1.8硫代硫酸钠溶液，见附录A84.1.92%Repel溶液，见附录A94. 2 DNA Marker: DL20004.3黄瓜 SSR（简单重复序列）引物，见附录 B5目的基因的分子标记5.1RIL（重组自交系）群体的建立5.1.1亲本的选择以携带有抗病基因的黄瓜品种或稳定自交系为父本，以不具有任何抗病基因的、高产的黄瓜品种或稳定自交系为母本。5.1.2杂交授粉母本扎花 DB23/T ×××x2007授粉前一天的傍晚，把母本植株上第二天早晨即将开放的雌花，用细铁丝夹往，同时将已开放的雌花和未人工授粉的幼瓜以及雄花摘除。父本扎花授粉前一天的傍晚，把父本植株上第二天早晨即将开放的雄花，用细铁丝夹住。授粉授粉时间从早晨露水于后开始，到中午结束。先采下父本上的雄花去掉花冠露出雄蕊，松开夹在雌花上的细铁丝夹，用父本的雄蕊轻蘸母本柱头，然后把父本的雄蕊插在雌花的柱头上，把花冠夹劳，挂上标签作为标记。采种黄瓜人工授粉后30d～50d采收。杂交一代（F）混收，从杂交二代（F2）开始单瓜采收。RIL群体的构建从杂交二代（Fz）开始采取单粒传的方法自交6代，建立RIL群体。5.2目的基因的分子标记5.2.1 DNA 提取a）取100mg新鲜幼叶，置1.5ml的离心管中加入液氮研磨成粉。b）加入提取缓冲液900μ1轻轻混勾。c)加入10%SDS100μ1，充分混勾，于65℃水浴中保温60min（间或晃动1次）。d）加入5mo1/L乙酸钾160μl，充分混匀，冰浴中放置30min。e）4℃下12000r/min离心15min。g）于4℃下8000r/min离心10min。（重复二次）h）上清液转入新离心管中，加入等体积氮仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻。i）于4℃下8000r/min离心10min。j）转移并量出上清液体积，置新离心管中，加入1/5倍体积的3mo1/LNaAC，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，-20℃放置数分钟。k）10000r/min离心5～10min，倾去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清液。1）用80%乙醇洗涤沉淀2次～3次，吹干。m）加入 40μ1 TE或dH20溶解 DNA，备用。5. 2. 2PCR（聚合酶链式反应）扩增反应体系（25μ1）见表1表1项目指标10xbuffer2.5 μ12.5 mM MgC122.0 μldINp 2.5 μ1gDNA模板（10 ng/μ1）2μl正向引物（10 pmo1/μ1）0.5 μ1反向引物（10pmo1/μ1)0.5 μl0HPP14 μlTaq DNA 聚合酶(1U/μ)1μl2 DB23/T ××××-2007反应程序见表2表2项目指标94℃ 预变性5 min94℃ 变性30 sec55℃退火1 min72℃ 延伸1 min30sec循环次数35次72℃ 延伸5 min4℃终止反应5.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳将PCR反应后的SSR材料每管加上1OμlLoading Buffer（在PCR板上），上面覆盖甘油，置于PCR仪中变性10min，取出，放入冰水混合物中冷却。冷却后放入4℃冰箱里保存，待用。制备6%聚丙烯酰胺凝胶。用微量移液器取 10ul左右的LoadingBuffer，隔一定距离点少许。然后开动电泳仪，开始预电泳30mins。用微量移液器取4.0μl电泳材料的样品，点入点样孔内，待所有的材料点完样后，开始电泳，恒功率100W电泳90min。银染a）固