DB37_T 2312-2013转hLTF基因奶牛的PCR鉴定技术规程.pdf

ICS 65. 020. 01B 01DB37山東东省地方标准DB 37/ThLTF基因奶牛的PCR鉴定技术规程Procedures for PCR Identification of Human Lactotransferrin Gene in TransgeneticDairy Cattle2013-04-01发布2013-05-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业大学、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司。本标准主要起草人：黄金明、侯明海、瀚志花、张思聪、冯敏燕、李秋玲、王长法、齐超、张燕、李建斌、何洪彬、戴蕴平、仲脐峰。I DB37/ThLTF基因奶牛的PCR鉴定技术规程1范围本标准规定了转hLTF基因奶牛的分子鉴定技术方法。本标准适用于转hLTF基因奶牛中转基因成分的分子检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法NY/T 672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T 1672绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程SN/T 1917牛地方流行性白血病聚合醇链反应操作规程NYB 9535转基因动物及其产品成分检测促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法DB37/T 2037牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1hLTF 基因人乳铁蛋白基因。3. 2转hLTF基因奶牛利用转基因技术将人乳铁蛋白基因导入奶牛细胞或胚胎，通过克隆技术培育而成的奶牛。4鉴定原理针对转hLTF基因奶牛含有的hLTF基因，根据转入的外源的人LTF基因与内源的牛LTF基因的同源性，在编码区设计hLTF基因特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，用凝胶电泳检测产物，依据产物的有无来判定试样是否含有转hLTF基因成分，从而判定为转hLTF基因阳性或阴性奶牛。主要试剂配制 DB37/T 2312—2013除另有规定，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682的双蒸水；试剂配制应按照DB37/T2037的规定执行。实验室应符合NY/T672的规定。6主要仪器设备按照DB37/T2037中的规定执行。7检测方法7. 1样本采集静脉采集血样3mlL5mL，ACD抗凝，4C或-20C保存，亦可采集耳组织0.01g~0.05g，液氮保存。7.2试样DNA提取7.2.1血液DNA的提取用酚-氯仿抽提法从抗凝血和血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的处理按照SN/T1917的规定执行。DNA的提取按照DB37/T2037中的规定执行。也可用商业化DNA提取试剂盒提取DNA。7.2.2组织DNA提取组织样品DNA的提取方法，参照NYB953-5执行，或者用商业化DNA提取试剂盒提取DNA7.3DNA浓度和纯度检测按照NY/T1672的规定执行。7.4引物序列用于扩增hLTF基因的特异引物序列。hLTF1 : 5′CTGGGACTAGAGGTGCTTGAC3hLTF2: 5′GGCAGATGGTAGGAGGTAGGA3上述扩增片段的大小为921bp。7.5对照DNA样品的制备7.5.1阳性对照DNA样品利用上述hLTF1和hLTF2引物对，以人的基因组DNA或者互补DNA为模版，采用常规PCR方法扩增hLTF基因片段，纯化后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌后，提取阳性克隆质粒，质粒（pMD18-hLTF）用测序验证。扩增的hLTF基因片段测序结果见附永A7.5.2阴性对照DNA样品从非转hLTF基因牛的血液或组织中提取DNA样品。7.6PCR扩增7. 6. 1PCR扩增体系2 DB37/T 2312—2013产物扩增的PCR反应体系：模板DNA50ng、10×Buffer2.5L、50mo1/LMgC121.2L、10mmo1/LdNTP0.6HL、TaqDNA聚合酶2U、10Hmo1/L的上游和下游引物各1.0且、加双蒸水至反应总体积为25 L.7.6.2PCR扩增反应的设计PCR扩增时包括以下反应管：若干待测样品（待测样品DNA为模板）管，空白对照（双蒸水作为模板）管，阳性对照（质粒pMD18-hLTF为模板）和阴性对照（不含hLTF成分的牛基因组DNA为模板）管。7. 6. 3PCR扩增条件94℃预变性5min；94℃变性30s，60C退火30s，72℃延