SN_T 3730.2-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第2部分：狗成分检测　实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.2—2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第2部分：狗成分检测实时荧光 PCR 法Identification of domestic animal ingredient in food and feed--Part 2 : Detection of canis ingredient-Real-time PCR method2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3730.2—-2013創言前 SN/T3730《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》共分为以下8个部分：第1部分：貂成分检测实时荧光PCR法；第2部分：狗成分检测实时荧光PCR法；第3部分：狐狸成分检测　实时荧光PCR法；第4部分：驴成分检测实时荧光PCR法；一一第5部分：马成分检测　实时荧光PCR法；-第6部分：猫成分检测实时荧光PCR法；第7部分：水牛成分检测　实时荧光 PCR法；第8部分：猪成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3730的第2部分。本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本部分主要起草人：高宏伟、林超、孙敏、刘彩霞、陈颖、吴亚君、韩建勋、黄文胜、邓婷婷。I. SN/T 3730.2--2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第2部分：狗成分检测实时荧光PCR 法范围SN/T 3730的本部分规定了雷肉食品中狗成分的检测方法。本部分适用于食品及饲料中狗组织成分的定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范　食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1狗 Canis属于犬科，犬亚科，犬属动物。3.2实时荧光PCRreal time FCR在PCR反应体系中加人荧光基团.利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.3Ct 值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyr ibonuleic acid)dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyr ibonucleoside triphosphate)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)Tris:三（羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)Taq:水生栖热菌（Thermus aquaticu)OD:光密度值(optical density) SN/T 3730.2—20135　方法提要样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用狗线粒体D-ILOOP基因特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在狗成分。6试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物（对)序列和探针：狗成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见表1。表 1试验用引物和探针目的基因名称序列(5-3)内参照5端引物F:5-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3内参照3端引物R : 5-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3真核生物18SrRNA基因内参照探针P: 5-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRA-3 F : 5-TCCAGGTAAACCCTTCTTCCC-3狗成分5端引物狗线粒体D-LOOP基闪狗成分3”端引物R : 5-TTACGAGCAAGGGTTGATGGT-35-FAM-ATCACTTAGTCCAATAAGG-MGBNFG-3狗成分探针6.2 CTAB缓冲液:55 mmol/L CTAB,1 400 mmol/L NaCI,20 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris,用10%盐酸调pH至8.0,121℃，高压灭菌 20 min，备用。6.3 TE缓冲液(Tris-C1、EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris-H