NY_T 1804-2009甘蔗花叶病毒检测技术规范.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1804-2009甘蔗花叶病毒检测技术规范Technical criterion of Sugarcane mosaic virus detection2009-12-22 发布2010-02-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 1804—2009前言本标准的附录 A、附录 B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所、国家重要热带作物工程技术研究中心。本标准主要起草人：刘志昕、王健华、陈业渊。I NY/T 1804—2009甘蔗花叶病毒检测技术规范警告一一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了甘蔗花叶病毒（Sugarcanemosaicvirus，SCMV)双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS1ELISA)及反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分子生物学检测方法。本标准适用于甘蔗种茎、甘蔗组培苗中的甘蔗花叶病毒的检测。2仪器和用具2.1主要仪器台式冷冻离心机、PCR仪、水平电泳装置、凝胶成像系统、水浴锅、酶标仪、恒温培养箱。2.2用具及耗材微量移液器、研钵、酶联板、离心管、PCR管、移液器吸头。3取样3.1种茎：取腋芽及其周围组织约10g，心叶约10g，4℃条件下保存，最多存放7d。3.2组培苗：取叶片1g～10g，4℃条件下保存，最多存放7d。4检测方法4.1双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)法4.1.1样品制备从取样（保存）材料中切取0.5g～1.0g组织，加入5mL抽提缓冲液研磨，4000r/min离心5min，取上清液作试样，4℃条件下保存备用。阳性样品为已知带SCMV的材料或试剂盒提供的阳性对照，阴性样品为已知不带SCMV的材料或试剂盒提供的阴性对照，按同样方法制备和保存。4.1.2操作步骤包被抗体：每孔加100μL用包被缓冲液按工作浓度稀释的SCMV抗体，37℃保湿孵育2h~4h或4℃条件下保湿过夜。洗板：用PBST洗液洗板4次，每次3min～5min。封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃保湿孵育1h～2h。洗板：同。加检测样品：每孔加人100μL试样，设阴性、阳性和空白对照（样品提取缓冲液），可根据需要设置重复，37℃条件下保湿孵育4h，或4℃条件下过夜。洗板同。加酶标抗体：每孔加人100μL经ECI缓冲液稀释至工作浓度的碱性磷酸酯酶标记抗体，37℃保湿孵育2h～4h。洗板：同。1 NY/T 1804—200加底物溶液：每孔加入100μL含1mg/mLPNP的底物显色缓冲液，在室温下避光保湿孵育30 min~60 min。0终止反应：每孔加入50μL3mol/LNaOH终止反应，在酶标仪上测定波长405nm吸光值（OD405），并打印结果。4.1.3结果判定样品OD405值/阴性对照OD405值大于或等于2，判为阳性；样品OD405值/阴性对照OD405值小于或等于1.5时判为阴性；样品OD4o5 值/阴性对照OD405值在1.5～2之间，应经进一步确认。4.2反转录-多聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法4.2.1引物上游引物 SCMV-F5:5-GAAGAWGTYTTCCAYCAAKCWGGAAC-3(W=T/A,Y= C/T,KG/T);下游弓1物 SCMV- R3: 5- AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC- 3;预期扩增片段为906bp。4.2.2操作步骤总RNA提取从取样（保存)样品中切取1g样品，加液氮在大小合适的离心管或研钵中研磨成粉末，转至2mL离心管，加600μL水饱和酚与600uL2×RNA抽提缓冲液，混匀，4℃12000r/min离心20min，上清转移至新离心管，加人等体积4mol/LLiCl，混匀后4℃沉淀过夜，4℃12000r/min离心20min，沉淀用70%乙醇漂洗数次，风干，用30uLDEPC处理过的水溶解，一70℃保存备用。采用RNA提取试剂盒的，操作步骤参照产品说明书。阳性样品为已知带SCMV的材料或SCMV提纯液，阴性样品为已知不带SCMV的材料，按同样方法制备和保存。反转录及PCR反应以样品总RNA，以及阴性、阳性对照总RNA为模板，可选用一步法RT-PCR试剂盒进行反转录和PCR扩增，实验步骤按产品说明书进行。若不是采用一步法RT-PCR试剂盒，以SCMV-R3为反转录引物，参照反转录酶产品说明合成cDNA,然后在PCR反应管中依次加入10×PCR缓冲液2μL、10mmol/L的四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTT