SN_T 3685-2013油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法.pdf

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SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3685—2013油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Leptos phaeria maculans (Desm)Ces. De Not.2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布O国家质量监督检验检疫总局P SN/T3685—2013前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、华中农业大学等.本标准主要起草人:赵晖、王振华、易建平、吴翠萍、李彬、周国梁、曾宪东、吴品珊、李国庆。1 SN/T3685-—2013油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于十字花科植物及植物产品中油菜茎基溃疡病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3油菜茎基溃疡病菌基本信息学名:Leptosphaeria maculans(Desm)Ces.DeNot.分类地位:真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),座囊菌纲(Dothideomycetes),格孢腔菌目(Pleosporales),格孢腔菌科(Pleosporaceae),小球腔菌属(Leptosphaeria),无性态为黑胫茎点霉[Phoma lingam(Tode ex Schw.)Desm]。传播途径:感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料是远距离传播主要途径。油菜茎基溃疡病菌的其他信息参见附录A、附录B。4方法原理根据油菜茎基溃疡病菌在寄主上的为害症状,培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子和分生孢子器形态,以及PCR特异扩增片段大小等特征进行结果判定。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、实时荧光PCR仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。5.2主要试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB/T6682中规定的要求。5.2.11%次氯酸钠。5.2.2DNA提取试剂:DNA提取试剂盒,异丙醇,无水乙醇。尿素提取液(7mol/LUrea、50mmol/LTris-HClpH8.0、62.5mmol/LNaCl、1%SDS),蛋白酶K(20mg/mL),苯酚:三氧甲烷:异戊醇(25:24:1)溶液,3mol/LNaAc(pH5.2)。5.2.3PCR试剂:10XPCR缓冲液(含25mmol/LMgSO),Taq酶,dNTP。1 SN/T3685—20135.2.4凝胶电泳试剂:琼脂糖,TAE,LoadingBuffer,EB。5.2.5麦芽琼脂培养基:麦芽提取物6.0g,琼脂3.0g.蒸馏水200ml,调整pH至5.2121℃,15min灭菌。5.2.6马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯浸粉5.0g,葡萄糖20.0g,氯霉素0.1g.琼脂13.0g.蒸馏水定容至1000mL,调整pH值至5.6,121℃高压灭菌20min。6病菌的鉴定6.1症状检查6.1.1取样取样品量1%~5%(若样品少可适量增大比例)的种子、植株的茎根部和叶部进行检查。6.1.2种子症状检查在解剖镜下挑选皱缩、干癌、变色、残缺的种子或有霉变的籽粒或病残体,每份种子样品挑选不少于500粒,用做病原菌的分离。另取1kg种子,用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛,取筛上物、筛下物和种子各1g~2g用于DNA提取。6.1.3植株症状检查主要检查茎根部和叶部。选取叫片上出现圆形或不规则形、稍凹陷、中部灰白色病斑、部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位。植茎则选取不规则形淡褐色斑,或灰白色病斑、稍凹陷、上生黑色小点,或茎基及根系溃疡、枯萎症状的病变部位(见附录B)。6.2PCR初筛6.2.1样品DNA提取取筛上物、筛下物和种子,或植株可疑病变组织各1g~~2g,液氮研磨后各取样0.1g~0.2g,采用商业化试剂盒提取DNA(见附录C)。6.2.2PCR检测PCR检测方法见附录D和附录E,重复3次。用油菜塞基溃疡病菌标准菌株DNA作阳性对照,用灭菌蒸馏水作空白对照。若PCR初筛结果为阴性,不用做以下实验;若PCR初筛结果为阳性,继续以下

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