SNT 2242-2008自然杀伤细胞活性试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2242--2008自然杀伤细胞活性试验Natural killer cell activity assay2008-11-18 发布2009-06-01实施中华人民共和国发布0国家质量监督检验检疫总局余层较810%5惑查计数码防伪 SN/T 2242-2008前言本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由中国国家认证认可监督管理委员会归口，本标准负责起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准参加起草单位：中化化工标准化研究所、江南大学和天津市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：吕刚、张园、赵黎华、冯智勐、于智睿、赵琢。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2242--2008自然杀伤细胞活性试验1范围本规范规定了自然杀伤细胞活性试验的测定方法、试验数据和评价。本规范适用于检测实验动物一次或多次接触化学物质后,对 NK 细胞活性的影响。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB14924.1实验动物配合饲料通用质量标准GB14925实验动物环境及设施3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1自然杀伤细胞natural killer cell, NK在无抗原刺激下能够杀伤多种有核细胞的淋巴细胞，NK细胞是一种能表达“天然细胞毒作用”的独特细胞,NK细胞存在于血液和淋巴组织中，也存在于无胸腺个体的血液和淋巴组织中，它是抗自发性肿瘤细胞和病毒感染细胞的第一道防线，在免疫监视中起重要作用。4测定方法4.1 乳酸脱氢酶(LDH)测定法4.1.1材料及仪器靶细胞K562或 YAC-1、Hanks 液、RPMI1640 培养液、青霉素、链霉素、谷胺酰胺、二巯基乙醇、乳酸锂或 L乳酸钠、硝基氯化四氮唑(INT）、盼嗪二甲酯硫酸盐（PMS)、氧化辅酶I（NAD)、O.2 mol/LTris-HCl缓冲液、可调微量加样器、96孔平底板、CO，培养箱、酶标仪、LDH基质液的配置见表1。表 1LDH 基质液的配制试剂浓度/(mol/L)乳酸锂5X10-2硝基氯化四氮唑6.6X10-4吩嗪二加酯硫酸盐2.8X10-4氧化型辅酶1.3×10-3将上述试剂溶于 0.2 mol/L的 Tris-HCl缓冲液(pH8.2)4.1.2操作方法动物选择选择健康6周龄～8周龄，雌性 CBA、C3H 或 BALB/C小鼠，试验前应在动物室适应7d。试验动物的饲养和环境设施应符合GB14924.1和GB14925。 SN/T 2242-—200动物分组按随机方法将动物分为对照组及染毒组，各组动物10只。染毒染毒剂量，染毒组一般设为 3个剂量组，高剂量为1/5LDso～1/10LDso，低剂量以不引起任何免疫毒性,在低、高剂量中设中剂量组。组间距通常为 5 倍或 2倍。4.1.3试验程序靶细胞制备试验前24 h将靶细胞(K562或 YAC-1细胞)进行传代培养，用以前 Hanks 液洗三次，1000 r/min离心10 min，悬浮在一定体积的 Hanks 液中,计数细胞，用 RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为1 X105 /mL效应细胞的制备经染毒后，将各组动物包括对照组用颈椎脱白法处死小鼠，取出脾脏，制备脾细胞悬液，整个操作在 4℃下进行,以保持 NK 细胞的活性；离心1000 r/min,10 min在.4℃下进行．.-弃上清液,将细胞悬浮在5mL冷的 RPMI1640完全培养液中；一计数细胞并检查细胞的活力(台酚蓝拒染法)；一用 RPMI1640完全培养液调整细胞浓度，如效应细胞与靶细胞之比按1：50,则效应细胞浓度为5×10°/mL。NK细胞活性检测-取靶细胞和效应细胞各1go.μL，加人U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔，加靶细胞和1%NP各100μL，上述各顿均设3_个复孔将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养4h~6-h将培养板在水平离心机上，1500min离必5min；每孔吸取上清液100 μL,置于 96 孔平底培养板中，同时加人LDH基质液 100 μL,反应3min。每孔加入1mol/L的HC30iμL，立即在酶标仪490nm处测定OD值。结果计算结果计算见式(1)：批应孔IOD一靶细胞自然释放孔OD最天释玫孔OD=靶细胞誉然释最孔OD×100%(1)NK 细胞活性（%】4.2同位素5Cr释放法4.2.1材料和仪器靶细胞K562或YAC-1、Hanks液RPMI1640培养液\效应小鼠脾淋巴细胞、Naz51CrO4比活性（