SN_T 4614-2016国境口岸玛雅罗病毒荧光RT-PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4614--2016国境口岸玛雅罗病毒荧光RT-PCR 检测方法Real-time RT-PCR method for Mayaro virus detection at frontier ports2016-08-23 发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸玛雅罗病毒荧光RT-PCR检测方法SN/T 4614--2016*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045)总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 880×1230　1/16　印张 0.5字数 10千字2017年12月第一版2017年12月第一次印刷印数 1—500*书号：155066·2-32345 SN/T 4614-2016言前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：孙肖红、马雪征、刘键、徐宝梁、白红岩、张丽萍I SN/T 4614—2016国境口岸玛雅罗病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了玛雅罗病毒检测的生物安全要求、标本的采集、运输和保存，标本的处理和荧光RTPCR 检测。本标准适用于玛雅罗病毒的荧光 RT-PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部卫科教发［2006]15号）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1玛雅罗病毒Mayaro virus;MAYV玛雅罗病毒是一种蚊传虫媒病毒，属于披膜病毒科甲病毒属，趋血蚊是其主要传播媒介，主要流行于澳大利亚。人类感染后临床表现类似登革热，有发热、寒战、头痛、眼睛痛，皮疹和关节炎，在缺乏实验室诊断时很容易被混淆为登革热。4缩略语下列缩略语适用于本文件。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数；Ct 值FAMFAM荧光染料，-种荧光报告基团;RNA核糖核酸;RT-PCR反转录-聚合酶链反应。5生物安全要求中华人民共和国卫生计生委发布的《人间传染的病原微生物名录》规定，玛雅罗病毒的未经培养的感染性物质、灭活材料的操作应在不同级别生物安全实验室进行。具体如下：-玛雅罗病毒相关的感染性材料的操作应在生物安二级(BSL-2或 ABSI-2)实验室内进行；玛雅罗病毒相关的灭活材料在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行；玛雅罗病毒感染性材料运输包装分类为B类,UN编号为UN3373。1 SN/T 4614--20166标本的采集、运输和保存6.1 人血清标本无菌采集可疑病人的静脉血 3mL～5mL,室温静置 30 min，然后500 g 离心10 min,收集上清（血清）于2mL螺口塑料管内，用耐低温油性记号笔记上编号，4℃以下送检。不能及时检测的标本应保存于70℃或以下温度。6.2蚊类根据实际工作需要采集蚊虫标本。将采集的蚊虫直接放人一20℃冰箱冻死后，取出，分类编号，按30只～50只-份，装人2mL螺口塑料管内，用耐低温油性记号笔记上编号，干冰或液氮运输，或一70℃以下保存待检。7 标本的处理7.1 人血清标本血清标本可直接提取核酸。7.2蚊类7.2.1从一70℃容器中取出蚊虫标本,倒人研磨器中。7.2.2加人1mL PBS或生理盐水吹洗，弃去液体后加人1mL PBS或生理盐水，反复研磨至组织碎片基本消失。7.2.3将研磨液吸入1.5mL离心管，配平后置预冷4℃的离心机上，20000g离心10min。7.2.4取上清液提取核酸。８荧光 RT-PCR 检测8.13主要仪器需要以下仪器：荧光定量PCR仪；超净工作台；生物安全柜；一高压灭菌锅;一低温高速离心机：最大离心力20000g；漩涡振荡器;冰箱:4℃、一20℃和-70℃;一移液器:10 μL、20 μL、100 μL、200 μL和 1 mL。2 SN/T 4614—20168.2主要试剂8.2.1核酸提取试剂：用美国 Qiagen公司QIAamp ViralRNAKit 提取病毒核酸1）。8.2.2荧光 RT-PCR 通用试剂:Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit,美国 Ambion 公司产品1’。8.2.3无 RNA 酶的 DEPC水。8.2.4　引物和探针：引物和探针序列见表1。表1玛雅罗病毒荧光RT-PCR检测的引物和探针扩增片段(E基因)引物/探针名称序