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引物设计原则及设计软件详解演示文稿 当前第1页\共有23页\编于星期三\23点 优选引物设计原则及设计软件 当前第2页\共有23页\编于星期三\23点 PCR引物设计及相关软件使用 → ← Sense primer Antisense primer 选择模板序列保守区域 当前第3页\共有23页\编于星期三\23点 1、引物设计原则 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 自由能分布 当前第4页\共有23页\编于星期三\23点 引物长度 一般引物的长度为15-30 bp，常用的长度为18-21bp。过长或过短都不合适，为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（18bp的序列在人类基因组中只会出现一次）。 决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度 Tm =（g + C）* 4 +（a + T）* 2 当前第5页\共有23页\编于星期三\23点 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%，以45-55％为宜 GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。 碱基