SN 1681-2005蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1681—2005蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法Protocol of diagnosis for American foulbrood of honey bees2005-09-30发布2006-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法SN/T 1681-—2005中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. bzcbs. com电话：6852394668517548中国标推出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.5字数8千字2006年1月第一版　2006年1月第一次印刷印数 1—2 000 SN/T 1681--2005前言本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)制定的《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》2004版。本标准的附录 A、附录 B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈世松、苏琳、张兆平、朱开元本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法1范围本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病的诊断方法。本标准适用于蜜蜂美洲幼虫腐臭病的检疫。2原理蜜蜂美洲幼虫腐臭病（American foulbrood of honey bees）是由幼虫芽孢杆菌（Paenibacilluslarvae)引起蜜蜂幼虫和蛹的一种细菌性、急性、毁灭性病害。病蜂的蜂盖子脾下陷、穿孔、封盖幼虫死亡，死亡幼虫的喙常从腐烂虫尸前端穿出形如伸出的舌状。幼虫芽孢杆菌外观是长杆状，两端稍圆，呈链状生长的趋势，大小不一，长约2.5m～5m，宽为0.5m。由于病原是细菌，故可以通过染色或经分离培养后染色，在显微镜下进行形态学检查，可初步得出诊断结论。确诊还需在选择性培养基上进行鉴别培养、生化试验和鉴别试验。3设备、材料和试剂3.1设备3.1.1普通光学显微镜。3.1.2恒温培养箱。3.2材料和试剂3.2.1无菌平皿。3.2.2载玻片。3.2.3 试管(10 mL)。3.2.4胡萝卜酵母琼脂培养基。3.2.5马铃薯培养基。3.2.6酵母浸膏培养基。3.2.7牛肉汁琼脂斜面。3.2.85%孔雀绿水溶液。%沙黄水溶液。3.2.10碱性美蓝(又称骆氏美蓝)染色液。3.2. 11稀释石炭酸复红染液。3.2. 125%的醋酸。3.2. 133无菌生理盐水。4采样方法及标准4.1采样比例一批蜂（幼蜂)数量小于或等于30只时全部采样。数量为30只～100只时，以30只采样量为基础，每增加10只，采样量增加1只。数量大于100只时，按每批总数的30%采样。4.2采样方法从蜂群中随机抽取子脾一张，按照5点式采样方法，分别从巢脾四角与中央各开启封盖幼虫房30个，观察是否有患病幼虫存在。采样时尽量采取变色或死亡幼虫送实验室检查。1 SN/T 1681—20055方法及判定5.1直接检查法5.1.1样品处理取被检样品，加少量无菌生理盐水制成悬浮液。将上述悬浮液1滴～2滴，放在干净的载玻片上涂匀，选择下列2种不同染色方法进行染色后，在普通光学显微镜下检查（1000×）。5.1.2孔雀绿、沙黄芽孢染色法将被检材料涂片经火焰固定后，加5%孔雀绿水溶液（参见附录A）于载玻片上，加热汽腾3min~5 min，用蒸馏水冲洗后,再加0.5%沙黄水溶液（参见附录A)复染 1min，蒸馏水冲洗，用滤纸吸于，在普通光学显微镜下检查（1000×）。结果判定：菌体呈蓝色，芽孢呈红色。5.1.3石炭酸复红染色和碱性美蓝复染法将被检材料涂片经火焰固定后，加稀释石炭酸复红液（参见附录A)于载玻片上，加热汽腾2min~5min，用蒸馏水冲洗后，用5%的醋酸褪色，至淡红色为止（约10 s），用蒸馏水冲洗，以骆氏美蓝液（参见附录A)复染半分钟，用蒸馏水冲洗，吸于或烘干，在普通光学显微镜下检查（1000×）。结果判定：菌体呈蓝色，芽孢呈红色。5.2分离培养与鉴定5.2.1分离培养无菌条件下，取备检样品少许于灭菌器皿内，加少量灭菌生理盐水制成悬浮液。将上述悬浮液（也可将悬浮液在80℃水浴中10 min，以杀死不形成芽孢的细菌再接种)接种于胡萝卜酵母琼脂(参见附录B)平板培养基或马铃薯培养基（参见附录B)、酵母浸膏(参见附录B)培养基上。置于恒温培养箱中，在30℃～32℃条件下培养24h～48h,取纯培养后的菌落（液）作涂片染色，镜检或生化试验。被检样品是蜂蜜，可直接取蜂蜜接种于上述培养基上，置于恒温培养箱中，在30℃～32℃条件下培养24h～48h，取菌落（液）作涂片染色，镜检或生化试验。结果判定：孔雀绿、沙黄芽