SN_T 2974-2011牛巴贝斯虫病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2974—2011牛巴贝斯虫病检疫技术规范Quarantine protocol for bovine babesiosis2012-04-01实施2011-09-09 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局D3数码防伪 SN/T 2974—2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准与OIE《陆生动物疾病诊断试验和疫苗标准手册》（2008年版）中第2.4.2章“牛巴贝斯虫病”的一致性程度为非等效。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出人境检验检疫局、四川农业大学。本标准主要起草人：姜红、王玉玲、赵祥平、余华、杨光友、严玉宝、胡娟。 SN/T 2974--2011牛巴贝斯虫病检疫技术规范1 范围本标准规定了牛巴贝斯虫病病原鉴定、酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验。本标准适用于牛巴贝斯虫病的检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3疾病概述牛巴贝斯虫病由牛巴贝斯虫（Babesia bovis）、双芽巴贝斯虫（B.bigemina）、分歧巴贝斯虫（B.divergens)等寄生原虫引起。该病可以引起牛的高热、全身循环性休克，血红蛋白尿以及某些神经症状,严重可导致死亡。参见附录A。牛巴贝斯虫病的诊断方法主要包括：病原鉴定和血清学检查。病原鉴定中传统的方法是显微镜检查。该方法可检测出低至10？个红细胞感染1个虫体。血清学实验包括间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验。其中，间接免疫荧光试验已广泛用于检测巴贝斯虫抗体，但一个突出的缺点是检测样品数量少,带有一定主观性。4诊断技术4.1镜检法4.1.1仪器和设备普通显微镜。4.1.2试剂和材料姬姆萨染色液，配制方法参见附录B。实验用水应符合GB/T6682要求。4.1.3采样部位因牛巴贝斯虫通常分布在毛细血管血液里，活牛样品最好取自耳尖或尾尖的毛细血管；牛双芽巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫均匀地分布于全身血液，如不能采集毛细血管血液做新鲜涂片，也可无菌采集颈静脉血加人抗凝剂EDTA(1mg/mL）,5℃保存，几小时内送达实验室。病死牛样品除薄血涂片外，还应有取自大脑皮层、肾、肝、肺和骨髓的组织涂片。4.1.4血涂片的制备在洁净的载玻片三分之一处蘸一小滴血，以一端缘光滑的载玻片为推片，将推片的一端置于血滴之1 SN/T 2974—2011前，待血液沿推片端缘扩散后，自左向右推成薄血膜，待其自然风干后，无水甲醇固定1min，10%姬姆萨染色20 min～30 min,此为薄血涂片;取一小滴血液（约50 μL)滴在干净的载玻片上，待血滴风干后，80℃加热固定5min，10%姬姆萨染色15min～20min，此为厚血涂片。虫种鉴别以薄血涂片为好。4. 1. 5组织涂片的制备脏器涂片的制作可用一块干净的玻片轻触脏器的新鲜切面或以两块洁净的玻片轻夹一小块组织，沿玻片的纵向推压，使两玻片上都留下一层组织。涂片风干后，无水甲醇固定5min，再用10%姬姆萨染色20min～30min。如果样品取自牛死亡后24 h或更长时间，其结果不可靠。4.1.6显微镜观察用油镜检查所有染色涂片（见图1、图2）。牛巴贝斯虫较小，通常位于红细胞中央，其平均长宽约为（1.0 μm～1.5 μm)×（0.5 μm～1.0 μm）,虫体常成对出现,且一端相连呈钝角。分歧巴贝斯虫也较小，其形态与牛巴贝斯虫非常相似，所不同的是呈钝角的成对虫体常位于红细胞边缘。双芽巴贝斯虫较长，成对虫体往往呈锐角相连，虫体呈典型梨形，但也有形状各异的单个虫体存在，长3.0μm～3.5μm，宽1.0um～1.5μm，成对排列的两个虫体各有两个不相连的红染点（牛巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫往往只有一个红染点）。0Oa)b)c)d)e图1牛红细胞内的双芽巴贝斯虫a)6c)d)e)图2牛红细胞内的牛巴贝斯虫4.2血清学方法4.2.1间接免疫荧光实验仪器和设备.1烘箱。.2水浴箱。.3荧光显微镜。2 SN/T 2974—20抗原片的制备选用染虫率达2%～5%的牛，从颈静脉采血制备抗原涂片。采血时加入适当的抗凝剂（柠檬酸钠或EDTA）。用5倍～10倍体积PBS至少洗涤3次，除去血浆蛋白。洗涤后,将感染红细胞重悬于2倍体积 PBS,并加人1%牛血清白蛋白（BSA）,取-一滴血液滴在干净的玻片上，以一端边缘光滑的载波片为推片，将推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。血涂片风干后，80℃烘箱固定5min，密封已固定的血涂