SN_T 2910.2-2011出口辐照食品的鉴别方法 第2部分：单细胞凝胶电泳法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2910.2—2011出口辐照食品的鉴别方法第2部分：单细胞凝胶电泳法Identification method of irradiated food for export-Part 2 : Single cell gel electrophoresis2011-09-09 发布2012-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2910.2—2011前言SN/T2910《出口辐照食品的鉴别方法》分为2部分：第1部分：电子自旋共振波谱法；第2部分：单细胞凝胶电泳法。一本部分为SN/T2910的第2部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、上海市质量监督检验技术研究院。本部分主要起草人：杨捷琳、张慧、巢强国、韩丽、刘俊平、王敏、王传现。I SN/T 2910.2—2011出口辐照食品的鉴别方法第2部分：单细胞凝胶电泳法1 范围SN/T 2910 的本部分规定了含有DNA辐照食品的鉴定方法。本部分适用于含有DNA的动物源食品（鸡肉、猪肉等）、植物源食品（种籽、干水果制品和调味品等)的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语及定义下列术语和定义适用于本文件3. 1彗星实验‧DNA comet asss各种因子诱发的细胞 DNA 受又称为单细胞凝胶电泳实验是一种单细胞DNA链断裂检测技术。损，会引起DNA 的高级结构变,DNAy片断将会迁移形成“彗”状尾部，故称为彗星实验。3.2彗星尾长　DNA tailing彗星头部中心到尾部最远端的距离。3.3DNA 百分含量percentage DNAin.tail彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例，即尾积分光强度/彗星积分光强度。3.4Olive tail momentOlive 尾矩尾部DNA占总DNA的百分比(3.3)与头、尾部中心间距的乘积。4　原理分离单个细胞后,将细胞固定在琼脂糖薄层中,使用去垢剂使细胞膜破裂,然后在一定电压下电泳，含有 DNA的细胞经过电离辐射的处理,核酸大分子发生单链断裂或双链断裂,DNA 片断将会迁移形成“彗星”状尾部。辐照过的细胞比未辐照的细胞 DNA断裂更剧烈,形成更多 DNA 碎片，从细胞核向电泳槽的阳极方向延伸，因此形成的“彗星”会更长、更宽（更多断裂）。未受辐照的细胞会显现出近似环形或者仅仅只有一个很小的尾巴。1 SN/T 2910.2—20115 试剂所有试剂除特殊注明外,均为分析纯,水参照GB/T 6822。5.1 盐酸:l mol/L。5.2二甲亚:DMSO。5.3磷酸盐缓冲生理盐水(PBS pH 7.4):见 A.1。5.4琼脂糖包被溶液：见A.2。5.54制胶溶液：见A.3。5.6EDTA储存溶液 0.5 mol/L:见 A.4。5.7TBE储存溶液：见 A.5。5.8电泳缓冲溶液：见 A.6。5.9裂解缓冲溶液：见 A.7。5. 10固定液:甲醇。5.11染色液 A:90 mmol/L NaOH 60 mL+25% NH;H,O 6 ml.。5. 12染色液B:40%（质量浓度）AgNO3。5.13染色液C:B液 2mL加人 A液,振荡至沉淀消失，定容至 100 mL。5.14显色液：1%（质量浓度）柠檬酸0.5mL+37%（质量浓度）甲醛0.5mlL，定容至100ml。5. 15脱色液：甲醇。5. 16终止液:将10mL冰醋酸用水稀释至1000mL。6 仪器6. 1DNA水平电泳槽。6.2电源:0 V~100 V,0 mA~400 mA。6.3秒表。6.4天平：感量0.001g。6.5 水浴锅。6.6加热磁力搅拌器。6.7微波炉。6.8筛布,孔径为100 μm,200 μm 和500 μm，例如尼龙。6.9载玻片：（76 mm×26 mm)单面磨砂。6.10盖玻片:（24 mmX60 mm)。6.11染色缸。6. 12显微镜：普通光学显微镜，放大倍数可达100×到400×。７ 步骤7.1单细胞悬浮物的制备7.1.1 概述制备的琼脂糖凝胶中分布的细胞应不相互重叠。制备细胞悬液时应保持低温，当加人终浓度为5%～10%的DMSO作为冷冻保护剂时，细胞悬液可在一18℃下保存更长的时间。2 SN/T 2910.2-20117.1.2动物组织 骨髓剖开骨头，取 50 mg骨髓，加人 3mL预冷的PBS。使用玻璃棒搅拌悬浮细胞。将细胞悬浮液用孔径为100 μm的筛布过滤。