SN 1379.2-2005猪瘟免疫荧光技术操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1379.2—2005猪瘟免疫荧光技术操作规程Protocol of direct immunofluorescent assay for classical swine fever2006-02-01实施2005-08-18 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1379.2—2005前言本标准的附录 A 为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国河南出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：张巨洲、苗丽、杨向莹、江志毅、张子宏、李辑。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I SN/T 1379.2—2005猪瘟免疫荧光技术操作规程1范围本标准规定了猪瘟免疫荧光技术操作方法。本标准适用于猪瘟病毒的检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本标准。3. 1IFA immunofluorescent assay免疫荧光试验。3. 2 CSF classical swine fever古典猪瘟(通称猪瘟)。3.3FITC fluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素。3. 4PK15 细胞 PK15cell猪肾传代细胞。3. 5BVDV/BMDV bovine viral diarrhea virus/bovine mucosal disease virus牛病毒性腹泻病毒/牛粘膜病病毒4原理免疫荧光技术是将病料冷冻切片或经盖玻片细胞培养病毒增殖后，置于固相载体上，用荧光素标记的抗体与其反应，形成病毒抗原-荧光素标记抗体复合物，在荧光显微镜下可见荧光。本标准以洁净载玻片为载体,将病料冷冻切片或细胞培养病毒增殖盖玻片固定在载玻片上，加人FITC标记的猪瘟抗体，反应结束后，置荧光显微镜下观察结果。5 器材与试剂5.1器材5.1.1荧光显微镜。5.1.2冷冻切片机。1 SN/T 1379.2-20055.1.3猪扁桃体采样器（带保定器材）。恒温培养箱。.5离心机。干燥灭菌箱。.7高压灭菌器。5.1.8 微量移液器。5.1.9纯水设备。5.1.10洁净载玻片、盖玻片和林氏管（Leighton 试管）。5.1.11 乳钵。5. 2 试剂5.2.1 猪荧光抗体。5.2. 2 猪瘟阳性血清。5.2.3 猪瘟阴性血清。5.2.4PK15细胞，无BVDV/BMDV感染。5.2.5胎牛血清：无BVDV/BMDV抗体。5.2.6PBS液(0.01 mol/L,pH7.2的磷酸缓冲盐水),配制见附录A,试验用水须符合 GB/T 6682的要求。70.5 mol/L碳酸盐缓冲甘油，pH(9.0~～9.5),配制见附录 A。.8丙酮(分析纯)。5.2.9 Hanks 液(见附录 A)。5.2.10 MEM 营养液(见附录 A)。乳汉液（见附录A)。5.2. 1120.25%胰酶消化液(见附录 A)。5.2. 125. 2. 13青霉素和链霉素。6 操作方法6.1 采样使用猪扁桃体采样器(参见附录B)，从活体摘取口扁桃体。剖杀病猪采取扁桃体、肾脏和回肠。采样后应尽快送检，如当日不能送检，必须冷冻保存，避免组织腐败、自溶。现场解剖检查时,若有条件可采取病猪扁桃体、脾、肾等病料时制作压片。标本自然干燥后,预冷的丙酮中，固定 10 min，自然于燥后，置冰箱内待送检。6.2 冷冻切片在实验室内将样品组织块修切出 1 cmX1 cm 的面,不经任何固定处理,直接冻贴于冷冻切片托上（组织块太小时，如活摘的扁桃体可用冷冻切片机专用的包埋剂包埋），进行切片。切片厚度以 5 μm～7 μm 为宜。将切片展贴于洁净载玻片上。6. 3 病毒增殖6.3.1 将 2 g 扁桃体或脾脏,剪成小块,在乳钵中研成匀浆。用 Hanks 液或 MEM 配成 20%悬液,加上青霉素（终浓度为500IU/mL)和链霉素（终浓度为500μg/mL），室温下放置1h，3000r/min离心15min，取上清液备用。6.3.2将PK15单层细胞用0.25%胰酶消化分散后，800r/min离心10min，用含无BVDV抗体的5%胎牛血清的 MEM配成2×10°/mL的细胞悬液。6.3.39份细胞悬液加1份制备好的上清液接种于加有小盖玻片的林氏管。另设不加病料的对照若干管，于接种后 1d、2 d、3 d分别将 2管培养物及1管对照细胞用 Han