SN_T 2666-2010苜蓿细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2666—2010首细菌性萎蕉病菌检疫鉴定方法Identification of Clavibacter michiganesis subsp. insidiosus (McCulloch) Davis2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2666—2010前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张乐、张祥林、赵文军、王独、高文娜、丁翠珍。 SN/T2666—2010首细菌性萎蕉病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了首细菌性萎蕉病菌[Clavibactermichiganensis subsp.Insidiosus（McCullochDavis]的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境首种子及其产品中首细菌性萎病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1809进出境植物种子检疫规程3原理首猎细菌性萎焉病菌的分类地位属于厚壁菌门（Firmicutes）、厚壁菌纲（firmibacteria）、真细菌目（Enterobacteriaceae）、棒形杆菌属（Clavibacter）。该病菌的生物学特性（参见附录A）、血清学特性和分子生物学特性是制定本标准的主要依据。4仪器设备和用具4.1仪器设备电子天平（感量1/10000g）、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜（具照相系统）、高速冷冻离心机、低速离心机、纯水器、恒温水浴锅、低温冰箱、酶标仪、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、电动搅拌机等。4.2用具培养血、试管、可调式微量进样器（2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)及其枪头、研钵、96孔酶联反应板、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2mL）、量筒、烧杯。5试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。培养、鉴定首细菌性萎病菌所用的试剂见附录B、附录C并参见附录D。1 SN/T2666—20106检疫鉴定方法6.1常规生物学检测6.1.1田间调查及植株检验首细菌性萎焉病在田间的典型症状是植株矮化、丛生，叶变小、褪绿，根部维管束组织变褐色。田间调查时采集具可疑症状的植株根、茎带回实验室，用清水冲净，晾干后用干净剪刀剪成1cm左右的小段，无菌操作下，将各样品用有效氯1%的次氯酸钠做表面消毒1min～3min（视材料粗细而定），无菌水清洗3次后，置于无菌空培养血中，加少量无菌水，用灭菌玻棒挤压，然后用接菌环蘸取菌悬液，在改良Burkholder琼脂培养基（含250×10-°的放线菌酮）平血上划线分离，20℃恒温培养5d～7d，观察菌落生长情况。6.1.2种子检验依据SN/T1809的规定随机抽取25g首猎种子（约10000粒）为一份样品，用电动搅拌机将种子样品打碎，然后悬浮于250mL无菌水中，4℃冰箱过夜；室温下在振荡器上以250r/min振荡30min，用MN-6061/4滤纸过滤。每毫升滤液中加0.1mL37%（质量浓度）甲醛溶液，室温孵育1h。然后以7000r/min离心10min，重新悬浮于2mL蒸馏水中。将其均分为3份，其中1份做分离培养检验，另2份加10%甘油保存，分别用做ELISA和PCR检测实验~10-5）后，取每个稀释度0.1mL在改良Burkholder琼脂培养基将上述菌悬液经倍比稀释（10平板上分离，重复2次～3次，在20℃～22℃培养5d～7d，观察菌落特征。典型菌落特征同6.1。6.1.3病原菌的生理生化鉴定将供试菌株悬浮于50μL～100μL蒸馏水，在金氏B培养基平板上划线，20℃～22℃培养5d~7d，观察菌落形态及色素产生情况，然后进行下列生理生化测试，首猎萎病菌在金氏B培养基形成客，能产生颗粒状蓝黑色色素。其生理生化特性具体参见淡黄色、圆形，边缘光滑，有光泽，无荧光的菌落表A.1。6.2双抗体夹心酶联免疫吸附法检测见附录C。6.3PCR法检测见附录D。7鉴定特征7.1常规生物学检测首猎细菌性萎病菌在该培养基上可形成淡黄色、圆形、边缘光滑、有光泽、略隆起或扁平的菌落，大多数菌株在7d～12d后产生典型的蓝黑色色素，颗粒状