SN_T 3640-2013出口食品中致泻大肠杆菌检测方法 PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3640—2013出口食品中致泻大肠杆菌检测方法PCR 法Determination of diarrheagenic escherichia coli in food for export--PCR Method2013-08-30 发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局医真 SN/T 3640—-2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局本标准主要起草人：徐君怡、王秋艳、董伟峰、郑秋月、曹际娟、刘冉、赵昕、田苗。1 SN/T 3640---2013出口食品中致泻大肠杆菌检测方法PCR 法范围1本标准规定了出口食品中致泻性大肠杆菌，包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、肠侵袭性大肠杆菌的ICR检测方法。本标准适用于出口食品中致湾性大肠杆菌，包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、肠侵袭性大肠杆菌的PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB/T4789.36　食品卫生微生物学检验　大肠埃希氏菌（157:H7/NM检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室.生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范1食品分子生物学检测3缩略语下列缩略语适用于本文件DNA:deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸dNTP:deoxyribonuclecosideltriphosphate，脱氧核苷三磷酸bp:base pair,碱基对Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane，三(羟甲基)氮氨基甲烷EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸TE:Tris-Cl、EDTA缓冲液SDS:sodium dodecyl sulfate,十二烷基硫酸钠CTAB:cetyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化胺4防污染措施按照GB19489和GB/T27403中的有关规定执行。5试剂和材料除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。5.1水：应符合GB/T 6682中一级水的规格。1 SN/T 3640--20135.2TE溶液:见附录 A中A.1.1。5.3 10%SDS。5.4 蛋白酶 K(20 mg/mL)。氯化钠溶液(NaCl):5 mol/L 和 0.7 mol/L。5.5复5.6 10%CTAB。5.7三氯甲烷。5.8 异戊醇。5.9 酚。5.10异丙醇。5.1170%乙醇。5.1210×PCR缓冲液:见 A.1.2。5.1350×TAE缓冲液：见 A.1.3。6主要仪器和设备紫外分光光度计。6.1#6.2 PCR 仪。6.3电泳装置。6.4离心机(离心转速14 800g,730g)。6.51PCR超净工作台。6.6灭菌 PCR反应管。6.7凝胶分析成像系统，7操作步骤7.1样品制备、增菌培养和分离肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌按照GB/T4789.6中的方法进行。.2肠出血性大肠杆菌O157:H7按照GB/T4789.36中的方法进行。7.2细菌 DNA模板的制备对于上述方法培养的增菌液，可直接取该增菌液1ml，加到1.5ml.无菌离心管中。12000g离心1min；吸弃上清，取沉淀，加567μLTE溶液，悬浮，加30μl:10%SDS和3μl.蛋白醇K，混匀.37℃温浴 1 h;加 100 μL 5 mol/L NaCl,混匀,加 80 μL CTAB/NaCl溶液(10% CTAB 和 0.7 mol/L NaCI),混匀，65℃温浴10min；加等体积三氯甲烷/异戊醇（体积比为24：1），混匀，12000g离心10min；取上清液，加等体积酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比为25：24：1），混勾，12000g离心10min；取上清液，加0.6倍体积异丙醇，轻轻混勾，12000g离心10min；取沉淀，用70%乙醇清洗2次。干燥，加100μl.TE溶液溶解，此即为DNA溶液。若不能立即检测，可保存于一20℃备用。用于阳性对照的菌株应按7.2的步骤同时进行DNA的制备操作。7.3DNA浓度和纯度的测定取5μLDNA溶液加ddH²O梯度稀释至1ml，使用核酸蛋白分析