SN_T 3494-2013动物及其加工产品中转基因成分PCR筛查方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3494—2013动物及其加工产品中转基因成分PCR筛查方法Protocol of the PCR method for screening genetically modified componentin animals and their derived products2013-03-01发布2013-09-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3494—2013言前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出人境检验检疫局、中国农业大学、中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘建、林祥梅、朱振营、吕继洲、李丹丹、郑海松、王建武、韩雪清、梅琳、邓俊花、仇松寅、王建峰。 SN/T 3494—2013动物及其加工产品中转基因成分PCR筛查方法1范围本标准规定了动物及其加工产品中转基因成分PCR检测方法。本标准适用于动物及其加工产品中转基因成分筛查检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20190　饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链反应(PCR)法GB/T 21101 z动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1转基因transgene将本物种不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导人手段，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp 碱基对(base pair)。CMV启动子：人巨细胞病毒(human cytomegalovirus promoter）。dATP:脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate)。dCTP:脱氧胞苷三磷酸（deoxycyticine triphosphate）。dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate）。dNTP:脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）。dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）。DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）。GFP:绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）。NPT I :新霉素-3-磷酸转移酶基因(neomycin-3-phosphotransferase gene)。SV40:猿猴空泡病毒 40(Simian Vacuolating virus 40)。Taq 酶:DNA 聚合酶。TE:Tris-HCl、EDTA缓冲液。1 SN/T 3494—2013Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]。5 试剂5.1JPCR 用引物内参照基因引物设计参照GB/T20190和GB/T21101，外源基因引物设计见表1（序列参见附录 A，相关文献参见附录B）。将合成的引物加人无离子水配成100 pmol/μI贮存，配成直接用于PCR反应的10 pmol/uL的工作液。表 1检测转基因动物内外基因所需的引物序列被检测基因基因来源引物序列备注扩增长度/bp5GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA-3猪线粒体基因内源212内对照5-ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-35-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3内源271内对照牛线粒体基因5-GTAGGCTGGGGAATAGTACGA-3-TATTAGGCCTCCCCGTTGTT-3294(山羊）内源羊线粒体基因内对照-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3295(绵羊)5-CTATTCGGCTATGACTGG-3NPT I外源263筛查检测5′-TGAGATGACAGGAGATCC-3′ 5-GTCATTAGTTCATAGCCCATA-3CMV启动子外源483筛查检测52-GCGGAGTTGTTACGACATTT-3′-TGTTTATTGCAGCTTATAATGG-3外源96SV40 PolyA筛查检测5-ACAAACCACAACTAGAATGC-35°-TTCTTGAAGTCCGCCATG-3′外源GFP311筛查检测5GTGTTCTGCTGGTAGTGG-35.2药品及试剂TαqDNA聚合酶，琼