SN_T 3395-2012蜱类携带森林脑炎病毒、伯氏疏螺旋体、贝氏柯克斯体PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3395-2012蜱类携带森林脑炎病毒、伯氏疏螺旋体、贝氏柯克斯体PCR检测方法PCR detection methods for tick borne encephalitis virus, borreliaburgdorferi,coxiella burneti2013-07-01实施2012-12-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局涂真 SN/T 3395—2012前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨宇、韩辉、慈颖、李明、宋锋林、王静、胡孔新、包力、姚李四、魏莲、王勤忠、刘丰、孙肖红。1 SN/T 3395---2012蜱类携带森林脑炎病毒、伯氏疏螺旋体、贝氏柯克斯体PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸蜱类携带病原体中森林脑炎病毒、伯氏疏螺旋体、贝氏柯克斯体PCR检测方法。本标准适用于国境口岸蜱类携带重要病原（森林脑炎病毒、伯氏疏螺旋体、贝氏柯克斯体)的排查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1293国境口岸蜱类监测规程WS233实验室生物安全1级实验室要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1森林脑炎病霉tick borne encephalitis virus属于黄病毒科黄病毒属，衣壳二十面体对称外有包膜，含血凝素糖蛋白，核酸为单链正股 RNA,病毒在自然界循环于蜱和野生动物中，啮齿动物如灰鼠、野鼠、刺猬等均为本病的传染源。当蜱吸受染啮齿动物的血液后，病毒在蜱体内繁殖，并可越冬和经卵传代，故蜱不仅是传播媒介也是重要的储存宿主。3.2伯氏疏螺旋体Borrelia burgdorferi属于疏螺旋体属，是引起莱姆病的病原体，革兰氏染色阴性，基因组由一个线性染色体和许多环形和线性质粒组成，传播媒介主要是某些硬蜱，主要储存宿主是野鼠类和哺乳动物。3.3贝氏柯克斯体Coxiella burneti属于柯克斯体属，是引起人畜共患病Q热的病原体，革兰氏染色阴性，通过蜱传播给野生啮齿动物和家畜，再经受染动物的粪便、尿污染环境，由接触或呼吸道感染人。4生物安全要求蜱传病原体检测应在生物安全Ⅱ级以上实验室（BSL-2）内进行，实验室操作依照GB19489，WS233要求进行。5实验仪器设备PCR扩增仪；生物安全柜；电泳仪；冰箱；普通台式离心机；高速冷冻离心机（转速可达20000g）；凝胶成像系统；微量可调移液器（10μL、100 μl、1000 μL);旋涡混匀器；超净工作台。1 SN/T 3395—20126　主要试剂DNA 提取试剂盒;RNA提取试剂盒;dNTP;10×PCR缓冲液;Taq酶;反转录试剂;引物.引物序列见表 1;5XTBE电泳缓冲液;琼脂糖;乙醇;PBS。表 1PCR检测所用引物序列病原种类引物名称引物序列（5′-3)扩增片段大小上游引物TBEVfAGCCACAGGACACGTGTA森林脑炎病毒156 bp下游引物 TBEVCATCTTGACCATGGGAGA上游引物 CF1AAGTGCGATATTAATGAC伯氏疏螺旋体630 bp下游引物CR2GATCTTTCTGCCACAAGAG上游引物OMP1AGTAGAAGCATCCCAAGCATTG501 bpTGGCTGCTAGCTGTAACGATTG下游引物OMP2贝氏柯克斯体GAAGCGCAACAAGAAGAACAC上游引物（OMP3438 bp下游引物OMP4TTGGAAGTTATCACGCAGTTG注：其他等效商品化试剂盒或等效引物也可使用。７ 检测程序7.1蜱类标本的采集按照SN/T1293要求采集蜱标本，装人2I.螺口塑料血清管内，于一70℃以下保存待检。7.2蜱类标本的处理方法在无菌操作台上，将蜱取出放在无菌的平血内.用75%酒精没泡20min，用无菌滤纸吸干蜱体表酒精，再用生理盐水漂洗3次，用无菌滤纸吸干蜱体表水分后，倒人研磨器中！加人1mI.PBS或生理盐水吹洗，弃去液体后加人1mLPBS或生理盐水反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸人1.5mL离心管，预冷4℃的离心机上，20000离心10min。取上清液郭可进行分子生物学核酸的提取。7.3蜱类样本 DNA 的提取可使用商品化试剂盒，参照附录A进行。7.4　蜱类样本 RNA的提取可使用商品化试剂盒，参照附录B进行。7.5 PCR 检测7.5.