NY 543-2002牛流行性热微量中和试验方法.pdf

ICS 11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 543--2002牛流行热微量中和试验方法Micro-neutralization test for bovine ephemeral fever2002- 08-27 发布2002-12-01 实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 543--2002前言牛流行热(简称BEF)又称牛暂时热、三日热、一日热、僵硬病等，本病在亚、非和大洋洲许多国家均有发生。该病是由弹状病毒科暂时热病毒属牛流行热病毒引起的一种急性、热性传染病,呈周期性流行。在发病期间，对牛的产奶量、使役能力、增重、精液品质都有严重影响，还可导致少数病牛瘫痪，流产甚至死亡。严重危害养牛业的发展。本标准是根据我国科研成果，与澳大利亚合作研究成果和我国的实践经验制定的。本标准的附录 A、附录 B、附录 C 为规范性附录,附录 D为资料性附录。本标由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：白文彬、严隽端。 NY/T 543--2002牛流行热微量中和试验方法1范围本标准规定了牛流行热微量血清中和试验技术。本标准适用于牛流行热的诊断、免疫监测和流行病学调查。2 微量血清中和试验2.1 器材2.1.1营养液和0.05%胰酶EDTA(简称ATV)液，配制方法见附录A。2.1.2细胞及其制备、传代、计数方法，见附录B。2.1.3抗原（指示毒）、标准阳性血清、阴性血清由法定单位提供，按说明书使用。抗原毒价以及工作抗原(100 TCIDso)测定方法见附录C。2.1.4微量滴定板：无菌带盖96孔微量滴定板（简称微量板）。2.1.5微量加样器：25μL、50μL及100μL单道和多道加样器，加样塑料滴头（装量为25μL～100 μL，与加样器配套使用）。2.1.6二氧化碳培养箱。2.2操作方法2.2.1 灭活被检血清以及阴、阳性血清用前均于 56℃水浴锅中灭活 30 min。2.2.2准备制备工作抗原(指示毒)方法（见第C.1章），将已知毒价的合格种毒用生长液（见第A.1章)稀释成100 TCIDs./mL.2.2. 3 定性试验2.2.3.1向微量板的每孔各加25μL生长液。2.2.3.2在第一排加被检血清，每份占2孔，每孔25μL，混合均勾，即成2倍稀释。2.2.3.3用多道加样器从第1孔取25μL液体对应移人第2排孔内，混勾即成4倍稀释。再从孔内吸出 25 μL丢弃。2.2.3.4每孔加工作抗原25μL，混勾置37℃孵育60min。2.2.3.5每孔加细胞悬液100μL(30000个细胞）。细胞计数方法见第B.3章。2.2.3.6 试验对照系统的设置。每批试验的对照系统的设置：标准阳性血清，从第 1 列至第 6 列,每列4孔，逐列稀释（即2倍～64倍）,标准阴性血清、细胞对照和病毒对照各1列4孔。同时对本试验使用的工作抗原，随同试验再次进行测定。2.2.3.7用灭菌的盖子盖上微量板，置37℃二氧化碳(CO,)培养箱内，培养5d。从第3d起逐日记录细胞病变效应(CPE)。2.2.3.8结果判定：标准阳性血清中和抗体价≥64,标准阴性血清、病毒对照排各孔均出现CPE,工作抗原含量滴定在规定的范围之内(CPE出现的孔数与毒价查阅方法见第D.1章），细胞对照孔正常情况下，4倍稀释的被检血清列，两孔都出现CPE时，判为阴性；仅1孔出现CPE，被判为可疑，应再重复试验一次;两孔均不产生 CPE 时,则被判为阳性。 NY/T 543-20022.2.4定盘试验(测定抗体滴度)2.2.4.1向微量板的每孔各加25μL生长液。2.2.4.2每份被检血清在微量板第1列占4孔，每孔加25μL即待检血清为2倍稀释。2.2.4.3用多道加样器将2倍稀释的每份待检血清混匀后，吸取25μL对应移人第2排孔内，混匀即为 4 倍稀释,以此类推,直至稀释≥64 倍,最后一列各孔内混合血清各丢弃 25 μL。2.2.4.4每孔各加工作抗原 25μL，但细胞对照不加工作抗原，置37℃下孵育 60min。2.2.4.5每孔加100μL细胞悬液(30000个细胞）。2. 2. 4. 6s盖上灭菌盖，置 37℃二氧化碳(CO2)箱内培养5d。从第 3d起逐日记录CPE。2.2.4.7对照系统各项试验内容、方法与定性试验相同。2.2.4.8半数感染量的终点、中和抗体价计算和查阅方法见附录D。 NY/T 543—2002附录A(规范性附录）营养液和 0. 05%胰酶 EDTA配制方法A.1RPMI1640营养液的配制RPMI1640粉末10.4 g1 000 mL无离子水或双蒸馏水！充分溶解后经0.22 μm孔径微孔滤膜滤过除菌。细胞培养生长液是在滤过除菌营养液的基础上