SN_T 3583-2013白尾病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3583—2013白尾病检疫技术规范Quarantine protocol for white tail disease2013-08-30 发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3583-2013前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草本标准采用国际动物卫生组织（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2009版）中2.2.6章WhiteTailDisease.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：岳志芹、赵玉然、王群、张曼、郑小龙、孙明君、郑腾、孙涛、梁成珠、徐彪。1 SN/T 3583--2013白尾病检疫技术规范1 范围本标准规定了白尾病的临床诊断、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法、嵌套式反转录-聚合酶链式反应(nRT-PCR)方法和原位杂交检测方法。本标准适用于白尾病的流行病学调查、监测、诊断和检疫2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样3缩略语下列缩略语适用于本文件。WTD:白尾病(white tail disease)WMD:肌肉白浊病(white muscle disease)MrNV:罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rgsenbergi nodavirus)XSV:超小型病毒(extra small virus）RT-PCR:逆转录-聚合酶链反应(reverse-transtription-polymeras(Hain reaction)nRT-PCR:嵌套式 RT-PCR(Nsted RT-PCR)OD:光密度(optical density)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylen diamine tetra-aceticjacid)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)ISH:原位杂交(In-situ hybridisation)TEA:三Z醇胺(triethanolamine)SSC:标准柠檬酸盐(standard saline citrate)NBT:氯化硝基四氮唑蓝(Nitrotetrazolium Blue chloride)BCIP:5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate)4　设备4.1 PCR仪。4.2电泳仪。4.3凝胶成像仪。4.4切片机。4.5烘箱。4.6恒温恒湿培养箱。1 SN/T 3583-—20134.7 冷冻离心机。4.8电子天平。4.9高压灭菌锅。5 试剂5.1 Trizol。5.2 dNTP:含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。5.3Taq酶:5 U/μl，一20℃保存，避免温度剧烈变化。5.4M-MIV反转录酶:6 U/μL，一20℃保存，避免温度剧烈变化。5.5 引物。5.5.1RT-PCR检测 MrNV用引物:F1 :5-GCG-TTA-TAG-ATG-GCA-CAA-GG-3;R1 :5-AGC-TGT-GAA-ACT-TCC-ACT-GG-3。扩增MrNV衣壳蛋白425 bp的片段。5.5.2RT-PCR 检测 XSV 用引物:F2 :5-CGC-GGA-TCC-GAT-GAA-TAA-GCG-CAT-TAA-TAA-3;R2 : 5-CCG-GAA-TTC-CGT-TAC-TGT-TCG-GAG-TCC-CAA-3 。扩增XSV衣壳蛋白546bp的片段。5.5.3nRT-PCR检测 MrNV 用内引物：F3 :5-GAT-GAC-CCC-AAC-GTT-ATC-CT-3;R3:5-GTG-TAG-TCA-CTT-GCA-AGA-GG-3。扩增MrNV衣壳蛋白205bp的片段。5.5.4nRT-PCR 检测 XSV用内引物：F4 : 5-ACA-TTG-GCG-GTT-GGG-TCA-TA-3;R4 : 5-GTG-CCT-GTT-GCT-GAA-ATA-CC-3。扩增XSV衣壳蛋白236bp的片段。5.5.5ISH引物序列:KS:5′-TCGAGGTCGACGGTATC-3;SK:5′-CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3。5.6 Triton X-100。5.7 Davidsons 固定液。5.8 DEPC。5.9无 RNA酶的蛋白酶 K。5.10正常山羊血清。5.11羊抗地高辛碱性磷酸酶。NBT。5