SN 1543-2005食源性致病菌基因芯片鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1543—2005食源性致病菌基因芯片鉴定方法GeneChip methods for identification of foodborne pathogens2005-02~17发布2005-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码伪 SN/T 1543—2005前言本标准的附录 A和附录B为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：顾鸣、曹际娟、黄新华、韩伟。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。H SN/T 1543-2005食源性致病菌基因芯片鉴定方法1 范围本标准规定了食源性致病菌基因芯片检测方法。本标推适用于食源性致病菌的定性检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标推的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1193基因检测实验室技术要求3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1. 1食源性致病菌foodborne pathogens来源于食品和农畜产品、可造成人体健康危害的一类细菌。3.1.2聚合酶链反应 polymerase chain reaction聚合酶链反应，简称PCR。其原理是使用二条短寡核苷酸作为反应的引物，二条引物的序列与待测核苷酸(为模板)中某特定位点具有互补作用，而本身之间不发生互补作用。在镁离子、四种单核苷酸（dNTP）、模板 DNA及引物的条件下,PCR反应在DNA 聚合酶催化下，通过温度的瞬间变化使 DNA发生变性、退火及延伸反应，从而合成两个互补位点之间的DNA片段。这样的反应反复进行，使第一个循环产生的DNA片段得以扩增。经25个～30个循环，扩增倍数达10°。3. 1.3引物pimer应用化学方法合成一对与已知待扩增基因片段二侧DNA序列互补的寡核替酸,作为 PCR 扩增的起始物。3.1.4基因探针 gene probe在基因芯片检测或其他基因杂交检测中，应用化学方法合成已知特异性DNA序列的寡核苷酸片段，并且用标记物进行标记的一类寡核苷酸产品。3.2缩略语下列缩略语适用于本标准。PCR polymerase chain reaction 简称 PCR。Genechip gene chip 基因芯片。DNAdeoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸。1 SN/T 1543—2005dNTPdeoxyribonucleoside triphosphate脱氧核苷酸三磷酸。dATP deoxyadenosine triphosphate 脱氧腺苷三磷酸。dCTP deoxycytidine triphosphate 脱氧胞苷三磷酸。dGTP deoxyguanosine triphosphate 脱氧鸟苷三磷酸。dTTP deoxythymidine triphosphate 脱氧胸苷三磷酸。dUTPdeoxyuridine triphosphate脱氧尿苷三磷酸。bp base pair 碱基对。4设备和材料4.1微生物实验室通用玻璃器皿、移液管、培养皿等。4.2恒温培养箱：30℃～60℃。4.3台式小型离心机。4.4移液枪:0.5 μL~1 000 μL。4.5水平式电泳仪。4.6PCR 扩增仪。4.7凝胶电泳紫外检测仪。4.8pH计。4.9非荧光基因芯片扫描仪。4.10＇恒温水浴锅。4.11PCR操作柜。4. 12纯水器，双蒸水器。4.13 杂交箱。4.14芯片点样仪。5试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯，实验用水为灭菌去离子水和超纯水。5. 1 基因芯片检测所用引物序列5.1.1真细菌、霍乱弧菌、弯曲菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物(对)序列为：16-S: 5-BIOTIN-GGAGCATGTGGTTTAATTCG-3*16-A : 5′-BIOTIN-CGACACGAGCTGACGACA-3*5.1.2E.coli0157:H7、副溶血性弧菌检测用引物(对)序列为：23-S:5-BIOTIN-GAAAGGCGAAAAGAACC-323-A : 5*-BIOTIN-ACAAAAGGTACGCAGTCAC-3 5.1.3福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌检测用引物(对)序列为：16-A : 5-BIOTIN-GCTGCCTCCCGTAG-3*SHI-F : 5′-BIOTIN-TAA