NY_T 1902-2010饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验.pdf

ICS 65.120B 46NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1902—2010饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验Microbiological examination of Listeria monocytogenes in feeds2010-07-08 发布2010-09-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T1902-2010言前本标准遵照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心(北京)]。本标准起草人：饶正华、李丽蓓。I NY/T 1902—2010饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验1范围本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验方法。本标准适用于对饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的分离、鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单)适用于本文件-GB/T14699.1饲料采样(ISO6497,Animalfeedingstuffs-Sampling,IDT）3仪器与设备除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1冰箱。3.2恒温培养箱：30℃±1℃、36℃士1℃。3.3均质器。3.4显微镜：目镜10×，物镜10×～100×。3.5电子天平：感量0.1g。3.6锥形瓶：100mL、500mL。3.7平皿：直径90mm。3.8试管:16 mmX160 mm。3.9吸管：lmL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。4培养基和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水应符合二级用水的规定。4.1增菌肉汤(LBr、LBz）：见附录A第A.1章。4.2PALCAM琼脂：见附录A第A.2章。4.3OXA琼脂：见附录A第A.3章。4.4科玛嘉李斯特氏菌显色琼脂。注：由法国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这一一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。4.5含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆琼脂（TSA-YE)：见附录A第A.4章。4.6革兰氏染色液：见附录A第A.5章。4.7SIM动力培养基：见附录A第A.6章。4.8羊血琼脂：见附录A第A.7章。4.9含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆肉汤(TSB-YE)：见附录A第A.8章。4.10缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用)：见附录A第A.9章。4.11糖发酵培养基：见附录A第A.10章。1 NY/T1902—20104.12过氧化氢酶试验：见附录A第A.11章。4.13单核细胞增生李斯特氏菌和阴性对照标准株，如英诺克李斯特氏菌（L innocua）和伊氏李斯特氏菌(L.ivanovii)。4.14API李斯特氏菌鉴定系统。注：由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。5采样采样数量和方式按GB/T14699.1执行（采样工具必须是灭菌的）。包装为袋、瓶和罐装的样品，应从完整的未开封的包装中采取。固体样品应边取边混和；液态样品应通过振摇混匀。采集的试样密封后，应尽快送到微生物检验室，一般应不超过3h。如果时间过长，可将试样于0℃～5℃中保存。6试样的制备超过1mm孔径筛的样品需要研磨，研体必须事先灭菌。制备的试样要在密闭瓶中低温保存。饲料试样若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在24h之内检验。7操作步骤7.1增菌以无菌操作称取试样25g（或25mL)加入到含有225mLLB增菌液的均质容器中，在均质器上连续均质1min~2min。于30℃士1℃培养24h，移取0.1mL，转接于10mLLB²增菌液内，于30℃士1℃培养18h~24h。7.2分离取LBz增菌液分别划线分离于PALCAM琼脂平板、OXA琼脂平板或科玛嘉显色培养基上，于36℃士1℃培养24h～48h，观察各个平板上生长的菌落。在PALCAM琼脂平板上，单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落为小的圆形灰绿色菌落，周围有黑色沉淀形成的晕圈；在OXA平板上，典型菌落呈现浅棕色，在其周围形成黑色晕圈，培养48h后，菌落颜色加深，黑色晕圈的范围扩大。在科玛嘉显色平板上，典型菌落呈规则蓝色菌落并带有白色晕环。7.3纯化自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上可疑菌落，分别在TSA-YE平板上划线纯化，于36℃士1℃培养24h。7.4鉴定7.4.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋