制药公司牛病毒检测SOP.docxVIP

细胞培养法及荧光抗体检测 （1）样品制备：取约250ml的新生牛血清供试品用于检测，将其配制成含15%供试品的培养液，用于检测全过程的细胞换液及传代。以检测合格的血清作为阴性对照血清。 （2）指示细胞制备：至少采用猴源（如Vero细胞）、以及2种牛源细胞（BT和MDBK细胞或无病毒污染的原代牛肾细胞）以及人二倍体细胞作为指示细胞。细胞复苏后至少传代一次后使用。根据所需量制备足够量的细胞。 （3）用含有供试品的培养液将4种指示细胞分别接种于75cm2细胞培养瓶中，接种量应使细胞在培养7天后可达到至少80~90%汇合。同时制备阴性对照血清培养瓶。将培养瓶置37℃、5%CO2培养箱中培养至少7天。可在第5天时换液一次。 （4）第7天进行第1次盲传，将接种供试品及阴性对照的每种指示细胞培养瓶分别传出至少2个75cm2培养瓶，继续培养至第14 天，在第12天时可换液一次。 （5）在第13天时（或第2次传代前1天）或阴性对照瓶细胞达到至少70%汇合时，制备阳性对照用细胞。即取1个阴性对照细胞瓶分别传至6孔板或其它适宜的细胞板中用于细胞病变观察（CPE）、血吸附检查（HAd）及荧光抗体检测（IF），次日接种阳性对照病毒。 （6）第14天时进行第2次盲传。将第1次传代后的细胞培养物分别传至6孔板或其它适宜的细胞板中，进行细胞病变观察及HAd检查时，接种于每种指示细胞上的待测样本至少接种3孔；进行