SN_T 4848.4-2017出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第4部分：桉树.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4848.4-—2017出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法实时荧光PCR法第4部分：桉树Identification of common honey plant species in export honey-Real-time PCR method-Part 4 : Eucalyptus2017-07-21 发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局庭梦真饼 SN/T 4848.4---2017前言实时荧光PCR法》系列标准共分为8部分：SN/T4848《出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法第1部分：荆条；第2部分：油菜;第3部分：洋槐；第4部分：按树；第5部分：搬树；第6部分：龙眼；第7部分：荔枝和龙眼；第8部分：紫云英。本部分为SN/T4848的第4部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国安徽出人境检验检疫局。本部分主要起草人：李想、韩丽、薛华杰、李辉、任怡菲、吴亚君、宗凯、陈颖、郑怡、门光琦、杨艳歌、韩建勋。1 SN/T 4848.4--2017出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法实时荧光 PCR法第4部分：桉树1范围SN/T4848的本部分规定了出口蜂蜜中桉树成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于出口蜂蜜中桉树成分（柠檬桉、蓝桉、巨桉、直干桉、大叶按、缘桉、赤桉)的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为0.5%（质量百分比）。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403---2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1蜂蜜honey蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。3.2桉树 eucalyptus桉树是桃金娘科桉属植物，花呈缨状，为粉红色，3.3实时荧光 PCRreal time PCR在PCR反应体系中加人荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析。3.4Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)1 SN/T 4848.4—2017dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleoside triphosphate)dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)UNG:尿嘧啶 N-糖基化酶(uracil N-glycosylase)CTAB;十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)Tris:三羟甲基氨基甲烷［Tris(Hydroxymethyl)aminomethane]EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylene diaminetetraacetic acid)Taq:水生栖热菌(Thermus aquaticus)OD:光度密度(optical density)FAM:羧基荧光素(Carboxyfluorescein)BHQl:黑洞猝灭基团 1(Black hole quencher1)。5方法提要提取样品 DNA，以桉树来源DNA为阳性对照，以其他蜜源植物 DNA 为阴性对照，无菌水作为空白对照，使用桉树的特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象判定是否存在按树成分。6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无 DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和探针：按树成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1。桉树引物扩增的靶标序列参见附录A。表1桉树基因扩增引物探针序列扩增片物种名称引物/探针序列（53）靶基因段长度F: