SN_T 0331-2013出口畜产品中炭疽杆菌检验方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0331--2013代替SN0331—1994出口畜产品中炭疽杆菌检验方法Method for the inspection of bacillus anthrax in animal by-products for export2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局( SN/T 0331—2013前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准代替SN0331—1994《出口畜产品中炭疽杆菌检验方法》。本标准与S比，主要技术性变化如下：-删除了大豆凝集素吸收实验、噬菌体裂解试验、串珠实验和动物实验；增加了荚膜染色、Ascoli反应和聚合酶链反应(PCR)试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王海艳、敖威华、赵治国、赵林立、郭铁筝、冯永胜。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN 0331—1994。1 SN/T 0331—2013出口畜产品中炭疽杆菌检验方法1范围本标准规定了出口畜产品中炭疽杆菌的检验。本标准适用于出口鬃、毛、绒、野生动物毛皮、生骨粒及其他畜产品中炭疽杆菌的检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室　生物安全通用要求3生物安全炭痘为人畜共患病，试验环境和防护要求按照GB19489执行。4培养基和试剂4.1无菌脱纤绵羊血（或马血）。4.2炭疽沉淀素标准抗原。4.3炭疽沉淀素阳性血清。4.4炭疽沉淀素阴性血清。4.50.7%碳酸氢钠营养琼脂平板：见附录A中A.1。4.6普通营养肉汤：见A.2。4.7普通营养琼脂平板：见A.3。4.8戊烷胖多粘菌素琼脂平板：见A.4。4.9PLET琼脂平板：见A.5。4.10碱性美蓝染色液：见A.6。4.11革兰氏染色液：见A.7。4.12洗样液：见A.8。4.130.5%石炭酸生理盐水：见A.9。4.14电泳级琼脂糖粉。4.15Taq DNA 聚合酶:5 U/μL。4.16100 bp DNA ladder Marker(脱氧核糖核酸分子量标准）。4.1710 倍浓度 Taq DNA 聚合酶缓冲液(10× Tap Buffer):15 mmol/L MgC1。4.18dNTP混合物：脱氧腺苷三磷酸（dATP）、脱氧胸苷三磷酸（dTTP）、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)各2.5 mmol/L。4.1950XTAE电泳缓冲液：见 A.10。4.206×加样缓冲液：见A.11。1 SN/T 0331---20134.21溴化乙锭溶液：见A.12。5设备和材料5.1恒温培养箱。5.2二氧化碳培养箱。5.3恒温水浴箱。5.4生物显微镜。5.5Ascoli 反应管（小试管，内直径约0.5 cm左右）。5.6高压灭菌器。微量加样器。5.75.8高速冷冻离心机。5.9PCR 仪。5.10水平凝胶电泳槽。5.11电泳仪。5.12凝胶成像系统。0细菌学检测6.1抽样6.1.1鬃、毛、绒和生骨粒按生产日期或原料来源划分批次，每批按30%开包（箱）抽样或在扎包（装箱）时由每包（箱）各取一份样品。无菌从每包（箱）的不同部位共捕样3g~~5g，装进灭菌的棉布袋内，将袋口扎紧，作上批次标记。将样品装入塑料袋或铁筒内，密封后送样6.1.2动物皮张应逐张取样，用灭菌棉拭子涂擦样皮的真皮面。将棉拭子插人试管，塞紧棉塞。将试管逐支用纸包裹，装入铁筒内，再用棉花或软纸填充空隙，密封后送样。6.2样品处理6.2.1鬃、毛、绒和生骨粒可以根据样品多少，将适合数量的同批样品（最多不超过10份）合编为一个检验样品单位，作好记录。从合编为一个检验样品单位的每个样品袋中各取1g～2g样品，一起放人个适当大小的灭菌三角瓶中。加样品量30～40倍（质量体积)的预冷洗样液于三角瓶中用灭菌瓶塞将瓶口塞严。将三角瓶冰水浴或 0℃～4℃冰箱内,间或摇动约 1h。将瓶中洗样液倒人500ml灭菌离心管中，盖住管口，以3000 r/min离心20 min。弃去上清液，加少许灭菌水，使沉淀均匀悬浮。将离心管静置5min～10min，待杂质下沉后，将上悬液移人另支灭菌试管内，于65℃恒温水浴加热30min。加洗样液后的样品于热处理前如不能及时检验，应贮存于0℃～4℃冰箱内，以防芽孢发芽。2 SN/T 0331—20136.2.2动物皮张动物皮张的棉拭子涂抹样品，如不能及时检验，应贮存于0℃～4℃冰箱内，以防芽孢发芽。6.3检验方法6.3.1平板接种、毛