SN_T 4525.4-2016出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第4部分：霍乱弧菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4525.4—2016出口食品中致病菌的分子分型MILST方法第4部分：霍乱弧菌Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 4:Vibrio cholera2016-06-28发布2017-02-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T4525.4—2016前 言SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法》共分10个部分：第1部分：沙门氏菌；第2部分：金黄色葡萄球菌；第3部分：副溶血性弧菌；第4部分：霍乱弧菌；第5部分：克罗诺杆菌；第6部分：化脓链球菌；第7部分：空肠弯曲菌；第8部分：致泻性大肠埃希氏菌：第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第4部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本部分主要起草人：付溥博、曾静、汪琦、张锡全、薛峰、蒋原、刘莉。 SN/T4525.4—2016出口食品中致病菌的分子分型型MLST方法第4部分：霍乱弧菌1 范围SN/T4525的本部分规定了出口食品中霍乱弧菌分子分型MLST检测方法。本部分适用于出口食品中霍乱弧菌的分子分型检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。|用文件，仅注日期的版本适用于本文主件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682·分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T1022一2010进出口食品中霍乱弧菌检验方法3术语和定义、缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文3.1.1管家基因 house-keeping genes所有细胞中均要表达的一类产物是对维持细胞基命活艺动所必需的，其基因序列高度保人文称看家基因.持家基因守并且在大多数情况下持续表达。3.1.2Taq DNA 酶Thermus aquaticus DNA polymerase从 Thermus aquaticus 细菌中提取的耐热 DNA 聚合酶3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）MLST：多位点序列分型（multilocus sequence typing)）ST:序列型（SequenceType)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]4原理MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列,对其组合进行索引编1 SN/T 4525.4—2016号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性。5试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒。5.2 Taq DNA酶。5.3dNTP:dATP,dTTP、dCTP,dGTP引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2。5.45.510×PCR缓冲液:200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾,15mmol/L氯化镁。5.6琼脂糖凝胶。5.7Gelred核酸染色剂。5.86×溴酚蓝上样缓冲液。5.9分子量标记：100bp2000bpDNAmarker5.10 5XTBE电泳缓冲液:445mmol/L Tris,445 mmol/L硼酸,10 mmol/LEDTA(pH8.0)。使用时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液。5.11质控菌株：霍乱弧菌Vbo非01霍乱弧菌或等效菌株。6仪器和设备6.1离心机。6.2天平：量程2kg，感量0.1g。6.3 pH计。6.4，涡旋振荡器。6.5 PCR 仪。6.6电泳仪。6.7凝胶成像仪。6.8基因测序仪。6.9超净工作台。6.10移液器:0.1μL~2.5μL、2μL~20μL、20μL200μL、100μL~1000μL。7检测程序