SN 1526-2005马巴贝斯虫病检测方法 微量补体结合试验法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1526--2005马巴贝斯虫病检测方法微量补体结合试验方法Determination of babesia equi--Micro-complement fixation2005-02-17 发布2005-07-01实施中华人民共和国发布敏码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1526—2005前言本标准的附录 C、附录 D 是规范性附录,附录 A、附录 B是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国天津出人境检验检疫局起草。本标准主要起草人：王玉玲、侯艳梅、赵祥平、杨金良。本标推系首次发布的出人境检验检疫行业标。 SN/T 1526--2005马巴贝斯虫病检测方法微量补体结合试验方法1 范围本标准规定了马巴贝斯虫病微量补体结合试验的操作技术要求。本标准适用于马属动物马巴斯虫病的血清学诊断。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用规格和试验方法3试剂和材料3.1 试剂3.1.1试验用蒸馏水为 GB/T 6682中的三级水。3.1.2稀释液：生理盐水。3.1.3补体结合抗原：按说明书使用，使用前充分摇勾。3.1.4标准阳性血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。3.1.5标准阴性血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。3.1.6溶血素:使用前用蒸馏水溶解至规定容积。3.1.7补体：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。3.1.8绵羊全血：选健康成年绵羊，无菌颈脉采血，1.2份阿氏液加1份血，混匀，4℃冰箱内保存5d后备用。3.2材料3.2.1玻璃试管:10 mm×75 mm,圆底,洁净。3.2.2试管架。3.2.3微量移液器。3.2.4可调连续加样器。3.2.596孔U型微量板。3.2.696孔平底(LJ)微量板。3.2.7ELISA读板仪。3.2.8水平转子离心机。3.3被检血精3.3.1采血和分离按常规方法采血和分离血清。血清必须新鲜,无蛋白絮凝物,无溶血,无腐败气味。1 SN/T 1526--20053.3.2运送和保存防止血清受热若3d内不能送到实验室，需用冷藏方法运送血清。血清应放至4℃冰箱内保存。4操作方法4.1预备试验4. 1. 1 3%红细胞悬浮液的制备绵羊全血充分混后，取所需量用稀释液洗三次，每次水平转子离心机 2 000 r/ min离心5 min,最后-次离心 10 min。取1份下沉血泥加人到24份稀释液中，充分混匀，制成红细胞悬浮液。取出250 μL红细胞悬浮液加人到4.75mL蒸馏水中，使红细胞充分破解(液体清亮）。取100L加人到平底微量板孔内，平行加8个孔。用ELISA读板仪540nm下读OD值，算出平均OD值，代人校正红细胞浓度见式(1)：bXca=c(1)0.115式中:一稀释液加人量；a:b——平均 OD 值;一红细胞悬浮液量。取校正红细胞浓度时所需的稀释液量加人到红细胞悬浮液中即得 3%红细胞悬浮液。4.1.2溶血素效价的测定 稀释溶血素取0.2mL溶血素原液,加人到19.8mL生理盐水中，制成1：100稀释的溶血素,再按表1稀释成不同稀释倍数的溶血素。表 1 溶血素的稀释稀释倍数溶血素量 /mL生理盐水/mL1 : 5001 ±100 溶血素1. 04. 01: 1 0001 * 100 溶血素 2. 018.01 : 1 5001:100 溶血素 0.57. 01 : 2 0001 : 100 溶血素 0. 59.51 : 3 0001 : 1 000 溶血素 1. 02. 01 5 0001 1 000 溶血素 1. 04.01 : 10 0001 : 1 000 溶血素 1. 09. 0注：如果溶血素是由等量甘油保存，则溶血素原液所需量如倍,并相应减少生理盐水量。制备不同稀释倍数的溶血素致敏红细胞取7个试管,每管加1.5mL 3%的红细胞悬浮液，然后分别缓慢加入不同稀释倍数的溶血素1.5mL，混匀，37℃水浴箱中感作15 min。2 SN/T 1526-200溶血素效价的确定将补体原液预稀释至1：150,按表2进行测定。表2溶血素效价测定3456712试管号1. 01. 01.01. 01.01.0稀释液/mL1.00. 50. 0. 50. 51/150补体/mL0. 50.50. 50. 50. 5 0. 50. 5不同稀释液倍数致敏红细胞/mL5 000*10 000*500*1 000*1 500*2 000*3 000*溶血素稀释倍数感