SN 1316-2003牛海绵状脑病组织病理学检查方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1316—2003牛海绵状脑病组织病理学检查方法Protocol of histopathological diagnosis for bovine spongiform encephalopathy2003-08-18 发布2004-02-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：马贵平、田海燕、刘艳华。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 1SN/T 1316—2003牛海绵状脑病组织病理学检查方法1范围本标准规定了牛海绵状脑病组织病理学检查方法。本标准适用于牛海绵状脑病的诊断。2 引用标准下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验用水规格和实验方法3材料3. 1被检组织牛脑组织。3. 2 试剂3.2.110%中性福尔马林。3.2.296%甲酸（分析纯）。3.2.3无水乙醇（分析纯）、95%乙醇溶液（分析纯）、80%乙醇溶液和70%乙醇溶液（由前液配制）。3.2. 4二甲苯(分析纯)。3.2. 5石蜡(熔点分别为52℃～54℃,54℃～56℃,56℃～58℃）。3.2. 6苏木素染色液（见第A.1章）。3.2.7盐酸乙醇溶液：100mL70%乙醇溶液+1mL盐酸3.2.8二级水(符合GB/T 6682)。3.2.9伊红染液（见第A.2章）。3. 2. 10无水乙醇：二甲苯(1：1)溶液。3. 2. 11封片剂：中性树胶或甘油乙烯乙醇溶液。3.2. 121%过氧化氢甲醇溶液。3.2. 13胰酶缓冲液(见第 A.3章）。3.2.14ABC 试剂盒。3.2. 15AEC 试剂盒(Proxidase Substrate Kit)。3.2.16PrP单克隆抗体。3.2. 17PBS(pH 7. 0,0. 15 mol/L)。3.3仪器设备3. 3. 1自动脱水浸蜡机。3.3.2包埋台。3.3.3 切片机。3.3.4展片槽。3.3.5烘于台。3.3.6自动染色机。 . -SN/T 1316-—20033.3.7封片机。3.3.8光学显微镜。3.3.9脱水包埋盒。3.3.10包埋模具。3.3.11载玻片及盖玻片（按常规方法处理）。4　方法4.1牛脑组织的固定将取得的新鲜牛脑组织浸10倍～20倍的10%中性福尔马林溶液中固定。一周后更换固定液。为了缩短固定脑组织的时间，可在三级生物安全实验室或二级生物实验室中的三级生物安全柜中,在被检牛脑组织上分别切取一定厚度(一般为2 mm～3 mm)的脑组织,装入脱水包埋盒中,放入 10%中性福尔马林溶液中固定。般 2 d～3 d即可。脑干区域切取可按图 1进行。a）背面b) 侧面BCA建议切取的水平部位：A-A=延髓,脑门部位;B-B一延髓小脑后脚部位;C-C=中脑前丘脑部位。图 1去除小脑的脑干4.2去除感染性将盛有牛脑组织的脱水包埋盒移至 96%甲酸中至少浸泡1h后，用自来水冲洗。4.3制备脑组织切片4.3.1组织脱水、浸蜡将上述处理后的组织(在脱水包埋盒中)放人自动脱水浸蜡机中，进行脱水浸蜡[70%乙醇溶液2h、80%乙醇溶液1h、95%乙醇溶液1.5h、无水乙醇1h、无水乙醇1.5h、无水乙醇2h、无水乙醇：二甲苯(1：1)溶液1h、二甲苯1h二甲苯2h、二甲苯2h;熔点为52℃～54℃、54℃～56℃和56℃～58℃石蜡中分别浸泡2 h、2 h和1 hl。4.3.2石蜡包埋浸蜡后，使用包埋机进行常规石蜡包埋。待石蜡完全冷却后,将模具与冷却的石蜡块分开。将制备好的组织石蜡包埋块放到4℃冰箱中备用。4.3.3切片、展片切片：将制备好的脑组织石蜡包埋块固定到切片机上，调整切片厚度为5μm，勾速转动切片机手柄切片。展片：将展片槽中的水加热到37℃～45℃，把切出的石蜡包埋组织轻轻的移人展片槽。烘干：用处理好的载玻片将组织从展片槽中捞出，使组织粘附于玻片的适当位置，放到烘于台2 ！1SN/T 1316—-2003i- --(50℃）上，烘干（约30 min）。也可在37℃温箱中过夜。干燥后的组织切片在室温下保存，待检。4.4 苏木素一伊红溶液(H.E)染色步骤14.4.1 二甲苯脱蜡:10 min。--.-4. 4. 2 二甲苯脱蜡:10 min。4.4.3二甲苯：无水乙醇(1：1)溶液:2 min～5 min。4.4.4无水乙醇:2