NY_T 2810-2015橡胶树褐根病菌鉴定方法.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2810—2015橡胶树褐根病菌鉴定方法Methods for identification of Phellinus noxius (Corner)G.H.Cunn of rubber tree2015-12-01实施2015-10-09发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 2810--2015前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由农业部农垦局提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所、厦门出人境检验检疫局本标准主要起草人：贺春萍、梁艳琼、林石明、李锐、吴伟怀、郑肖兰、郑金龙I NY/T 2810---2015橡胶树褐根病菌鉴定方法1范围本标准规定了橡胶树褐根病菌（Phellinus norius）的术语和定义、鉴定依据、试剂及配制方法、采样、症状鉴定、培养鉴定、PCR鉴定、结果判定、标本和样品保存等技术要求。本标准适用于橡胶树褐根病菌（P.norius)的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T28095木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件，3. 1橡胶树褐根病brown root disease of rubber tree由有害层孔菌[Phellinus norius(Corner)G.H.Cunn]引起的一种为害橡胶树根部的真菌病害。该病害病原菌的危害症状和培养性状见附录A。4鉴定依据依据褐根病菌在橡胶树上的为害症状、形态特征、室内病原菌培养性状以及PCR特鼻性反应进行鉴定。根据褐根病菌核糖体基因内转录间隔区（rDNA-ITS)特有碱基序列设计特异性引物进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期653bp的特异DNA片段，判断样品中是否携带橡胶树褐根病病菌。5试剂及配制方法5.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)称取200g洗净去皮的马铃薯，切碎，加一级超纯水900mL煮沸30min，纱布过滤，再加20g葡萄糖（化学纯）充分溶解后，用一级超纯水定容至1000mL，分装后，每100mL培养基中加人2.2g琼脂粉（高纯度），121℃高温灭菌20min，4℃或室温保存备用。马铃薯葡萄糖液体培养基不加琼脂粉。5.2试剂琼脂粉、葡萄糖、无菌水、75%酒精、氯化钠、0.1%升汞、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、氢氧化钠(NaOH)、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、冰乙酸、四环素、链霉素、异丙醇、无水乙醇、真菌DNA提取试剂盒、琼脂糖、液氮、蒸馏水、TaqDNA聚合酶、引物、DNA纯化试剂盒、PCR产物回收试剂盒、pMD18-TVector、感受态细胞、Goldenview核酸染料、DL2000Marker、TAE电泳缓冲液等。5.3试剂配制5.3.1四环素(Tetracycline)称取0.1g四环素溶解于无水乙醇，定容至10mL。以50ug/mL终浓度添加于生长培养基。5.3.2链霉素(Streptomycin)称取0.5g链霉素硫酸盐溶解于足量的无水乙醇中，最后定容至10mL。以100ug/mL的终浓度1 NY/T 2810—2015添加于生长培养基。5. 3. 31 mol/L Tris - HCI(pH 8. 0)称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris，优级纯）溶解于800mL一级超纯水中，用盐酸(HCl,分析纯)调pH至8.0，加超纯水定容至1000mL。分装后高温灭菌（121℃)20min，4℃或室温保存备用。5. 3. 410 mol/ L NaOH称取80.0g氢氧化钠(NaOH,分析纯)溶解于160mL一级超纯水中，溶解后再加一级超纯水定容到200mL。5. 3. 51 mol/ L EDTA - Na2 (pH 8. 0)称取372.2g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2，优级纯），溶解于70mL一级超纯水中，再加人适量NaOH溶液（5.3.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，再用NaOH溶液（5.3.4)调pH至8.0，加超纯水定容至100mL。分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。5.3.6TE缓冲液(pH8.0)分别量取10mLTris-HCl(5.3.4）和1mLEDTA-Na2（5.3.5），加一级超纯水定容至1000mL。分装后高温灭菌（121℃）20min，4℃或室温保存备用。5.3.750×TAE电泳缓冲液(pH8.0)称取242.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris，优质纯），先用500mL一级超纯水加热搅拌溶解后，加人100mLEDTA-Na2（