SN_T 4877.8-2017基因条形码筛查方法 第8部分：检疫性炭疽菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4877.8—2017基因条形码筛查方法第8部分：检疫性炭疽菌DNA barcoding screening method-Part 8 :Quarantine colletotrichum kahawae2017-08-29 发布2018-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4877.8—2017前言SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；-第3部分：检疫性植原体；第4部分：检疫性茎点霉；第5部分：检疫性拟茎点霉；-第6部分：检疫性嗜酸菌；一-第7部分：检疫性轮枝菌；一第8 部分:检疫性炭疽菌;-第9部分：检疫性腥黑粉菌；第10部分：检疫性疫霉。本部分为SN/T4877的第8部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、高瑞芳、王颖、史亚千、汪莹、段维军、向才玉、潘广、王红英、谢晓露。 SN/T 4877.82017基因条形码筛查方法第8部分：检疫性炭疽菌1范围SN/T 4877的本部分规定了咖啡浆果炭疽病菌Colletotrichum kahawae DNA 条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于进境植物及植物产品中咖啡浆果炭疽病菌的DNA条形码的筛查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 3679咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DNA 条形码DNA barcode生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2甘油醛-3-磷酸脱氢酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;GAPDH糖酵解反应中的一个酶,分子量146 kDa，为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达。在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定。4咖啡浆果炭疽病菌的基本信息英文名:pathogen of coffee berry disease学名 :Colletotrichum kahazwae J.M.Waller et Bridge异名:Colletotrichum coffeanum var.virulans (Rayner,1952)分类学地位：真菌界（Fungi），无性型真菌（Anamorphic fungi），炭疽菌属（Colletotrichum）。5方法原理使用 GAPDH基因作为咖啡浆果炭疽病菌的 DNA条码基因，通过对检测对象的 DNA进行 PCR扩增及产物测序后，利用 NCBI核酸数据库比对，根据序列相似度筛查物种。1 SN/T 4877.8—20176仪器设备和试剂6.1仪器设备超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、20℃低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。6.2 试剂氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、70%乙醇、无水乙醇、Tris饱和酚、TagDNA聚合酶、明胶、溴化乙锭、DNA片段标记物、DNA裂解液、PCR缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、dNTPs（dATP、dGTP,dCTP,dTTP)。7筛查鉴定方法7.1 DNA制备DNA制备方法见附录A。7.2DNA 条形码片段 PCR扩增利用GAPDH基因的通用引物进行GAPDH基因序列扩增，具体步骤见附录B,测序。7.3序列分析测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段测序质量Q值小于20的序列。利用美国国家生物技术信息中心（NCBI)在线数据库中比对GAPDH基因序列(/Blast.cgi).8 结果判定序列长度约为280bp，序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI)数据库中（FJ972584.1）比对相似度大于 99%时,即可筛查初步判定为咖啡浆果炭疽病菌，咖啡浆果炭疽病菌的 GAPDH 基因参考序列参见附录C。进一步鉴定按 SN/T 3679进行。9菌种保存9.1样品保存分离到的咖啡浆果炭疽病菌菌种,转入麦芽提取物琼脂（MEA)试管斜面培养基上，置于 4℃黑暗条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。9.2结