SN 1181.3-2003食道咽部口蹄疫病毒探查试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1181.3—2003食道咽部口蹄疫病毒探查试验Protocol of probang test for foot and mouth disease virus2003-03-17 发布2003-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1181. 3-2003前言本标准根据 OIE/Chapter 2.1.1,4th edition,2000，《诊断试验和疫苗标准手册》(Manual of stand-ards for diagnostic tests and vaccines)起草。本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、兰州生物药品厂。本标主要起草人：薛景山、吕宏、王小玉、陈兴芳、黄云君。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1181.32003食道咽部口蹄疫病毒探查试验范围1本标准规定了反鱼动物食道咽部的口蹄疫病毒查毒方法。本标准适用于反动物食道咽部口蹄疫病毒的分离。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682-1992分析实验室用水规格及试验方法3缩略语下列缩路语适用于本标。3. 1FMD foot and mouth disease口蹄疫。3.2FMDVfoot and mouth disease virus口蹄疫病薪。3.3OP oesophageal pharyngeal fluid食道咽部黏液。3. 4PBS phosphate buffered saline磷酸盐缓冲液。3.5CPE cytopathic effect致细胞病变。3.61, 1,2-trichorotrifluoro-ethaneTTE三氯三氟乙烷。3.7L-H水解乳蛋白溶液。4原理反负动物在感染FMDV后，其食道咽部具有长期带的特点。带毒时间因动物而异，往往数月或1 SN/T 1181.3--2003数年不等。这一过程被称为“持续感染”。这一机理尚不明确的带毒现象给动物检疫带来了新的挑战。这一特定带毒部位的发现使得从临床健康的感染动物中分离出感染病毒成为可能。普鲁斑试验就是通过对反台动物食道咽部这一特定带毒部位刮取分泌物，继而进行病毒分离鉴定的试验。试验采用特定的探杯刮取样品，用TTE处理样品以尽可能地降低可能存在的抗体对病毒分离的影响。将处理过的样品接种到对FMDV易感的初代细胞上培养以达到分离和扩增病毒的目的。将培养产物通过血清学试验或分子生物学试验方法进行鉴定从而达到确诊的目的。5材料准备5.1本标准所用水应符合GB/T6682一1992中三级水（三蒸水)的规格要求。5.2设备器材：食道探杯、5mL耐冷冻密封瓶、20mL广口瓶、普通恒温培养箱或二氧化碳培养箱、25mL细胞培养瓶或24孔细胞培养板、1mL～10 mL取液器，注射器、低温离心机、50 mL离心管、高速组织捣碎机、倒置显微镜、剪、镊、细胞滤网或纱布、组织培养瓶或组织培养板、生物安全柜和P3实验室。5.3运输保存液：0.08mol/LpH7.2PBS+0.01%牛血清白蛋白+0.002%酚红+抗生素（1000IU/mL青素，100IU/mL制霉菌素，100IU/mI.新霉素和50IU/mL多粘菌素），用7.5%碳酸氢钠(NaHCO,)调 pH至 细胞：从新生犊牛活体采取甲状腺制备犊牛原代甲状腺细胞（primary bovine thyroid cells），也可使用原代猪肾细胞、原代特牛肾细胞和原代羔羊肾细胞。具体方法见第7章。5.5硫乙醇酸盐(T.G)培养基、0.5%酚红、HankS溶液、0.5%I-H、7.5%碳酸氢钠(NaHCO,)溶液、细胞培养基、细胞维持液、胰蛋白酶溶液、抗生素等的配制见附录B。5.6TTE分析纯。6样品的采集、保藏和运输6.1将灭菌食道探杯插人动物口中，趁动物吞咽之际插人食道约15cm,取出时有意向咽部侧壁刮取。6.2将刮取的OP液倒人20mL广口瓶中检查其质量。OP液中应含有可见的细胞成分。样品中如污染了反乌的胃内容物则会变酸使病失活，要弃去重采。样品中尽量不要带血液。重采样品之前要用水或 PBS冲洗口腔。6.3取2 mLOP液与2mL运输保存液混合，混舍后的pH应是7.6左右，否则要调整。6.4将混合液保存于5mL密封瓶中。样品采集后要迅速冷藏或冰冻保存。如样品需几小时以上运输，则应将其放在干冰或液氮中进行运输。在冰冻之前要将螺