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PCR 引物设计流程详解本文目的：复制出 IL-4 基因片段 一、查找基因序列 1、进入 NCBI 主页，下拉选框选择 Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因，即 IL-4，点击搜索 2 、在搜索结果选择灵长类（Homo sapiens） 2、在灵长类 IL-4 基因中选择需要的 mRNA 序列 3、查看基因的相关信息 外显子区域 CDs 区域 4、点击 FASTA 格式，并将序列保存到文档 二、使用 primer premier 5.0 设计引物 1、建立新文件，将所得的序列复制进输入框内 2、点击搜索按钮，搜索引物 3、设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知，外显子区域分别为：1-200、201-248、249-425、426-618，又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子，PCR 产物长度通常为 100-150bp，故设定上游引物位置为201-248，下游引物位置为 249-425，产物长度为 100-150bp） 4、确认条件后，显示搜索结果 4、双击选中得分最高的引物查看引物情况 （上图为上游引物情况，下图为下游引物情况） 5、将设计的上下游引物复制出来，保存到文档中 三、使用 oligo 6.0 对设计的引物进行评价 1、建立新文件，将从 cnki 上获得的 cDNA 复制进输入框，并点击 accept 接收 2、接收后显示出该序列的相关信息 3、点击 edit 按钮录入用 primer 设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击 accept 按钮接收 4、同理，录入下游引物 5、分析上下游引物二聚体形成情况 6、分析上下游引物发卡形成情况 7、分析上下游引物 GC% 8、检测上下游引物与 PCR 模板其它位置错配情况 9、分析 PCR 整体情况 四、引物特异性检验（primer blast） 1、进入 NCBI 主页，并选择 blast 2、选择 primer blast 3、在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击 get primer 进行对比 4、查看 blast 结果 巨 t l 已 Etll = l89 氏 江n 屯 r u m｀巳 l ColG,U:.I,兀：n 皿－ J一L 七严 20 r 叮 l 叭 凹 汜1 9 , . , , , 凶 ．AT， 凸 9 砌 且名它FEc m｀立 l GI兀口了飞；如 切·一A lB r m pl Bm 汹 1 CA 忱 ，＇， 已 ，··, 9308 汛, k n:0叩 1 出盯 片5平em \W开丫 均 my n m氏 4 NV[IFY斗］．mRt从， -tL.:r,gtll= l89 F笠 于江 d 仪 正 l C入6人贝千汀T兀石I礼飞 ； 80 r 叩 l at 巴 饬 B , ．， ·凶，灯，＆ B:380 正 p :II立 L C口 飞CT闪 亢 江平寸- ....C』 lB r斗 at 巴 沁 1 C. 也 ，＇， C. 9跺8 寸侃＿叩 11 沁 书 :U. H11m 11 liil吐ns l5V1 5扛 屯 肛妇r ta 记 叩 住 ~. E 心 丘 ）阳 1) 1可 立 叩 顷 n寸 1 而 汪 印心 t 1巴1Eth ＝ 立 13 FowmId m漏庄 l C儿丸丘 亢 TT巴 I心 IL 七 2O r 叩 l” 让， 邓 ？ G r． 冗 ，C. , , , , . 31ll.8 吐 P 漏庄 l O - I IUIELL-l 1... 山 J H r 叩 l m 凹 峦 兀 ．r ., , , T, , ， 出 2 b 寸l NUl 可l兀1 3 比叮比：平 芒m 日 V1 中I cing 红 tor h叩 Dbg 佟 CEt 11牛壬 i 阴 (1 1 比 n 文中＂V工 1叩 12 m芯心， prochu:t l曰证 ＝ 立 13 F 叩 盯 d 严 士 叩立 l : m c 亿 门T巳勹·吐 LI U - 2 O [＂ p l at 巴 讼 1 G. r． 亢 ，已 ，＇，＇ 蛐 2?E 已 肛 l. 吐 芦 1 立r l 0 元 CTT可 E江 T可 心飞 30 r e 叩 l at 巴 作 冷 六 ，r a. , , , J, , , 7Y Blast 结果显示，尽管IL-4 与其它基因有相似区，但是引物的 3’端没有完全互补。故设计的引物能特异性的扩增出目的基因