SN_T 4631-2016水仙普通潜隐病毒的检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4631—2016水仙普通潜隐病毒的检疫鉴定方法Detection and identification of Narcissus common latent virus2016-08-23 发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局CXw215刮涂层查真伪 SN/T 4631—2016前 言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国农业科学院生物技术研究所、中国检验检疫科学研究院、浙江省检验检疫科学技术研究院、福建农林大学。本标准主要起草人：沈建国、廖富荣、李敏、李为民、张永江、邵碧英、刘正才、吴颖、高芳銮、吴祖建。T SN/T 4631—2016水仙普通潜隐病毒的检疫鉴定方法1范围本标准规定了水仙普通潜隐病毒的检疫鉴定方法本标准适用于进出境水仙鳞球茎、植株中水仙普通潜隐病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 21222进出境植物及植物产品检疫抽样方法SN/T2964植物病毒检测规范SN/T 3457植物病毒分子生物学检测规范3原理水仙普通潜隐病毒(背景资料参见附录A)的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。4仪器设备、用具及试剂4.1仪器设备高速冷冻离心机、电子天平（1/1000g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、一20℃低温冰箱和一80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶标仪等。4.2用具各种量程的可调移液器（1000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2 μL）、PCR 反应管、无 RNaseEppendorf 离心管（1.5 mL）、研钵、酶联板等。4.3试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。酶联板捕获抗原酶联免疫吸附测定法（Plate-trapped antigen ELISA，PTA-ELISA）试剂见附录 B、RT-PCR 试剂见附录 C、实时荧光 RT-PCR检测试剂见附录 D。5抽样和样品制备5.1抽样尽量抽取有病毒危害症状的材料，NCLV的危害症状描述参见附录 A；抽样方法按照 SN/T 21221 SN/T 4631—2016中规定执行。5.2样品制备分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照SN/T2964和SN/T3457中规定执行。6 检测与鉴定6.1 PTA-ELISA以含NCLV材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以样品提取缓冲液作为空白对照，具体操作见附录B。6.2 RT-PCR以含 NCLV材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照,同时以ddH²O代替模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录C。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。6.3实时荧光 RT-PCR 检测以含NCLV材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以 ddH2O代替模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测，具体操作见附录D。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。7结果判定与记录7.1结果判定当样品经PTA-ELISA、RT-PCR和实时荧光RT-PCR 三种方法中两种或两种以上检测结果为阳性时，则判定为检出水仙普通潜隐病毒。当RT-PCR检测结果为阳性、测定的序列为水仙普通潜隐病毒序列时，则判定为检出水仙普通潜隐病毒。7.2结果记录记录好各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。PTA-ELISA检测应有酶联反应数值；RT-PCR检测应有电泳图片；实时荧光RTPCR检测应有扩增曲线图片。8样品的保存经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在一20℃～一80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复核用。2 SN/T 4631—2016附录A（资料性附录）水仙普通潜隐病毒的背景资料分类地位A.1水仙普通潜隐病毒学名:Narcissus common latent virus,缩写:NCLV。分类地位：β线性病毒科（Betaflexiviridac）、香石竹潜隐病毒属（Carlauirus）成员。A.2寄主范围已报道的自然寄主为水仙（Narciss