NY_T 3237-2018猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA抗体检测方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 3237—2018猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA抗体检测方法Indirect ELISA for detection of antibodies against porcine reproductive andrespiratory syndrome virus2018-05-07 发布2018-09-01实施中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3237-—2018前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由农业农村部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：刘湘涛、田宏、陈妍、吴锦艳、尚佑军、何继军。I NY/T 3237—2018猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA抗体检测方法1范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA抗体检测方法的技术要求。本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗体检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3缩略语下列缩略语适用于本文件。ELISA：酶联免疫吸附试验PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered salinebuffer)4材料准备4.1猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白GP5蛋白的表达与纯化见附录A。4.2兔抗猪 IgG-辣根过氧化物酶试验前，用样品稀释液作1：40000稀释。4.3阳性对照血清猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）疫苗免疫仔猪制备，经间接免疫荧光检测PRRSV抗体为阳性。4.4阴性对照血清未免疫猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗及未感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的仔猪血清，经间接免疫荧光检测PRRSV抗体为阴性。4.5包被液配制见附录B中的B.1。4.6PBS配制见B.2。4.7洗涤液配制见B.3。4.8封闭液配制见B.4。4.9稀释液配制见B.5。4.10底物溶液1 NY/T 3237—2018配制见B.6。4.11终止液配制见B.7。5仪器及设备5.1酶标测定仪。5.2恒温培养箱。5.3微量移液器及配套吸头（20μL～200μL;100μL～1000μL)。5.4酶标板。5.51.5mL离心管。5.6一次性注射器。5.7稀释槽。6血清样本的处理6.1血清样本的采集和处理静脉采血，每头猪使用一个注射器，采血量不少于2mL。将血液置于15℃～25℃静置2h，待其自然凝固后2℃～8℃冰箱中静置不少于2h，4000r/min离心10min。用移液器小心吸出上层血清。6.2血清样本的储存与运输一周以内检测的血清样本可置于2℃～8℃冰箱中保存，保存时间超过一周的样本应置于一20℃以下冷冻保存。低温运送并及时送达，以确保血清样本有效。7操作方法7.1PRRSV重组抗原包被取96孔微量反应板，每孔加人用包被缓冲液稀释至工作浓度的PRRSV重组抗原100μuL（5μg/mL），置4℃过夜。7.2洗板弃去板中包被液，每孔加人220μuL洗涤液，重复洗3次，甩掉洗涤液并在吸水纸上拍干残留液体，7.3加封闭液每孔加人封闭液200uL，置于37℃恒温箱内2h。封闭结束后，弃去板中的封闭液，于吸水纸上拍干后，置于4℃保存备用。7.4加待检血清、阳性对照血清及阴性对照血清将待检血清、阳性对照血清及阴性对照血清用稀释液分别作1：20稀释，每孔加入100uL，每个待检样品及对照血清做两孔重复，置于37℃恒温箱内反应30min，取出反应板，弃去反应液，洗板同7.2。7.5加酶标抗体将兔抗猪IgG-辣根过氧化物酶用样品稀释液作1：40000稀释至工作浓度，每孔加人100μL，置于37℃恒温箱内反应30min，取出反应板，弃去反应液，洗板同7.2。7.6加底物溶液每孔加人底物溶液100μL(TMB)，置于37℃恒温箱内避光反应15min。7.7终止反应每孔加人终止液（2mol/LHzSO4）100μL，终止反应。7.8读数2 NY/T 3237—2018在酶标测定仪上读取各孔吸光值（OD450mm）。8结果分析8.1试验成立条件在酶标测定仪上检测各孔光吸收值（OD450mm），计算阳性对照平均OD450mm值和阴性对照平均OD450mm值。阳性对照平均OD450mm值1.0，阴性对照平均OD450mm值0.2，试验成立。8.2结果判定计算待检血清平均OD450mm值和阴性对照孔平均OD450mm值之比。当样品孔平均OD450mm值（S）与阴性对照平均OD450mm值(N)之比不低于2.4(即S/N≥2