SN_T 2979-2011兔魏氏梭菌病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2979--2011兔魏氏梭菌病检疫技术规范Quarantine protocol for rabbit clostridial disease2012-04-01实施2011-09-09 发布中华人民共和国X发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪， SN/T 2979—2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈兵、阮周曦、杨俊兴、秦智锋、陶虹、曹琛福、卢体康、花群义、张彩虹、陈书琨、1吕建强、林庆燕、孙洁、刘建利、廖立珊、宗卉。T SN/T 2979—2011兔魏氏梭菌病检疫技术规范1范围本标准规定了免魏氏梭菌病的临床诊断、病原分离鉴定、PCR检测方法技术要求。本标准适用于对进出境兔魏氏梭菌病检疫和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用提必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样GB19489实验室　生物安全通用要求3生物安全措施为保护实验室工作人员或检测人员的安全，所有培养物和废弃物应严格按照GB19489进行处理。4兔魏氏梭菌病临床诊断4.1 临床症状各种年龄和品种的兔均可感染发病，以1月龄～3/月龄的幼兔较多发生，发病不分季节。急性病例病免精神沉郁，食欲减退或废绝；起初粪便不成形，很快变成带血色、胶突然发作，急剧腹泻，很快死亡冻样、黑色或褐色稀便，且伴有特殊腥臭味，红门周围、后肢,尾部被毛被粪便污染。患兔严重脱水，四肢无力，呈现昏迷状态，逐渐死亡有的病免死前出现抽搐，个别突然兴奋，尖叫一声，倒地而死。多数病，少数病例病程药1星期或更长,最终死亡。例从出现变形粪便到死亡约10hs4. 2 病理变化兔魏氏梭菌病的剖检病变为尸体脱水、消瘦，剖开腹腔有特殊的腥臭味，多数病例胃内充满饲料，胃黏膜尤其胃底部黏膜严重脱落，胃壁有大小不等的出血斑和黑色溃疡；小肠充满气体，肠壁薄而透明；盲肠、结肠内充满有腐败气味的黑绿色稀薄粪便；肠黏膜呈弥漫性充血、出血；肝脏质地变脆；脾脏萎缩呈深褐色；心脏表面血管努张呈树枝状;数病例膀胱内积有茶色尿液。5 病原分离与鉴定5.1主要仪器与器材5.1.1恒温培养箱。5.1.2厌氧恒温培养箱。5.1.3光学显微镜。 SN/T 2979-20115.1.4 PCR 扩增仪。5.1.5电泳仪。5.1.6凝胶图像分析仪5.1.7普通冰箱和低温冰箱。5.1.88电动匀浆器或组织研磨器。5.1.9离心机和离心管。5.1.10微量移液器及吸头。5.1.11 剪刀、镊子。5. 1. 12平Ⅲ。5.2试剂5.2.1革兰氏染色液、0.05mol/LpH7.2 PBS、厌氧肉肝汤、葡萄糖鲜血琼脂平板、各类生化检测试剂等参见附录 A。5.2.2DEPC处理水、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇等。5.3采样按照GB/T18088 的要求进行。无菌采取病死兔空肠、回肠、盲肠内容物、脏器和心血，采集后立即冷藏送检或置缓冲甘油（用0.05mol/LpH7.2的PBS配制的50%的甘油溶液）中低温保藏。5.4染色镜检5.4.1涂片取兔空肠内容物、肝、脾或细菌培养液、单个菌落制作涂片，以涂片背面在火焰上钟摆方式通过三次进行固定。5.4.2初染在已固定的涂片上，滴加结晶紫染液，染色1min,水洗。5.4.3媒染滴加革兰氏碘液，作用1min～3min，水洗5.4.4脱色滴加95%酒精，并频频摇动玻片，至无紫色脱出为止（约20s），水洗。5.4.5复染滴加复红染液复染1 min～2min,水洗。用吸水纸印干后，油镜检查。5.5分离培养5.5.1样品处理将肠内容物加适量生理盐水，混匀，80℃加热10min，2000r/min离心10min。无菌采集的脏器及心血不需要处理，可直接用于细菌分离。5.5.2细菌分离取离心上清液或无菌采集的脏器及心血，接种于厌氧肉肝汤中，37℃于厌氧恒温培养箱培养20h～24h。2 SN/T 2979—2011取液体培养物划线接种在葡萄糖血液琼脂平板上，在厌氧恒温培养箱培养20 h～24 h。5.6生化试验将单个菌落的纯培养物接种于糖、醇类等生化反应培养基和牛乳培养基中。5.7 PCR 检测5.7.1PCR 检测引物针对免魏氏梭菌α毒素基因设计PCR检测引物：上游引物:5-GTT GAT AGC GCA GGA CAT GTT AAG-3下游引物:5-CAT GTA GTC ATC TGT TCC AGC A