SN 1618-2005李属坏死环斑病毒检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1618—-2005李属坏死环斑病毒检测方法Detection of prunus necrotic ringspot virus2005-08-18 发布2006-02-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1618—2005前言本标准的附录 A 为规范性附录,附录 B、附录 C 为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所负责起草，中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国陕西出人境检验检疫局参加起草，本标准主要起草人：李桂芬、李明福、魏梅生、相宁、张永江、韩丽娟、魏迪功。本标推系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1618—2005李属坏死环斑病毒检测方法1范围本标准规定了李属坏死环斑病毒检测和鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能带有李属坏死环斑病毒的所有进境的无性繁殖材料、组培苗、种子和果实的检测和鉴定。2原理2.1李庸坏死环斑病毒学名、分类地位学名:Prunus necrotic ringspot virus缩写:PNRSV分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae），等轴不稳环斑病毒属（Ilarvirus）。2.2寄主范围该病毒寄主范围广泛，自然和实验接种侵染21科双子叶植物，该病毒可侵染大多数李属植物、玫瑰、啤酒花。在人工接种的情况下还可侵染180余种植物。2. 3病害症状病害症状因分离物、栽培种和环境条件不同而不同。病毒的一些分离物不引起症状，仅仅在接种指示植物或用血清学等方法检测时才能发现被侵染；一些分离物在系统侵染的当年在幼叶上产生坏死斑和孔洞，但在以后的年份里，在叶子和果实上很少出现症状；另一些分离物在侵染当年产生坏死反应，随后是慢性的褪绿叶斑驳和坏死、叶子耳突、畸形、延迟水果成熟，水果上有斑点症状。如在甜樱桃上出现了从无症状到严重皱缩花叶症状，慢性症状包括叶子上的褪绿点、叶扭曲，水果延迟成熟几天至几周，症状因病毒分离物不同而不同。在玫瑰上无症状侵染很普遍，症状有花叶、开花延迟、秋天落叶早、产生更多不成形的花，被侵染的植株通常无活力。在啤酒花上产生褪绿线和环斑。2.4分布地区广泛分布在温带地区，如欧洲各国和美国都有发生。2.5传播方式机械接种传播、花粉传播、种子传播，也可通过无性繁殖苗木、组培苗的运输等人为途径进行长距离传播。2.6粒体形态李属坏死环斑病毒粒体为等轴对称球状体,直径 23 nm～27 nm,有些粒体为准等轴球状到短棒状（轴比为1.01～1.5);有些株系的病毒粒体呈明显的棒状(轴比大于2.2);有些棒状粒体达70 nm。棒状粒体的有无及比例因株系而异。2. 7病毒基因组正单链 RNA,3分体基因组,RNA-1长 3.662kb,RNA-2长 2.507kb,RNA-3长 1.887kb。3：仪器设备、用具及试剂3.1仪器设备酶标检测仪、天平（1/10 000 g）、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅等。1 SN/T 1618--20053.2用具可调移液器(200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、0 μL～10 μL、1 000 μL～5 000 μL)、可调移液器头、酶联板、eppendorf 管、指型管、研钵等。3.3试剂酶联检测试剂（见附录 A)、PCR检测试剂(见附录 B)。4 病毒检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(见附录 A)、生物学测定(见附录 C)、RT-PCR(见附录 B)检测方法进行检测。5 结果判定样品酶联检测为阳性,RT-PCR检测为阳性或生物测定鉴别寄主反应与附录 C 描述相吻合，即可判断为李属坏死环斑病毒。6样品保存和复核6.1样品保存鉴于李属坏死环斑病毒为检疫性有害生物，样品应保存在适合的条件下以备复核。如组培苗应保存在组培室中，生长苗木应保存在隔离温室中,种子应保存在干燥条件下。6. 2 结果记录与资料保存完整的实验记录要包括：样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。生物学测定需有鉴别寄主的症状照片，双抗体夹心酶联免疫吸附测定法检测需有酶联板反应的照片,RT-PCR检测需有电泳结果照片。6.3 复核由国家质量监督检验检疫局指定的单位或人员负责，主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。 SN/T 1618—2005附录A(规范性附录）双抗体夹心酶联免疫吸附测定法A.1 试剂A.1.1 包被缓冲液(pH9.6)碳酸钠（Na²CO;）1.59 g碳酸氢钠（NaHCO;）2. 93 g叠氮化钠（NaN;）0. 20 g用蒸馏水定容至 1 L。A. 1. 2 PBST 缓冲液(pH7. 4