SNT 2022-2007牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2022—2007牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction (PCR) forEperythrozoon wenyoni2007-12-24发布2008-07-01实施中华人民共和国1发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T前本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、华中农业大学。本标准主要起草人：李树清、胡永强、赵俊龙、王巧全、陈志飞、杜凯、王贵强、刘焕章。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2022—2007牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应操作规程1′范围本标准规定了温氏附红细胞体聚合酶链式反应方法。本标准适用于温氏附红细胞体的鉴定和检测。2概述手牛的红细胞或游离于胞浆的一种温氏附红细胞体（Eperythrd染 E.wenyoni一般不表现临床症状，立克次氏体，可通过吸血昆虫、螨虫、母体胎盘、血等8rRNA 的保守序列,设计了对特异引物严重感染引起发热、消瘦和黄疽。本标准根于温氏附红细胞体的鉴定和检测。mwF/mwR3,通过 PCR反应可扩增出3设备和材料3.1仪器设备3.1.1·PCR扩增仪。3.1.2 电泳仪。3.1.3凝胶成像系统。3.1. 4微波炉。3.1.5可调移液器(2 μL,10 μ3.1.6离心机。3.1.7天平(0.000 1 g)。3.1.8水浴锅。3.2耗材3.2.1 PCR 反应管。 mL离心管。3.2.3移液器滴头。3.3试剂3.3.1三蒸水 0.103 MPa 灭菌 15 min。琼脂糖。.3溴化乙锭。3.3.4Taq 酶(5 U/μL)。3.3.5 10×PCR 反应缓冲液。3.3.63氯化镁(MgCl²)25 mmol/L。3.3.71 mmol/L dNTP.3.3.8＇苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25：24：1)。3.3.9分子量指示物:100 bp～2 000 bp DNA Marker。3.3.1050 mg/mL溶菌酶、10%SDS、10 mg/mL蛋白酶K、5 mol/L氯化钠(NaCl)、5%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、2mol/L乙酸钠（NaAc）、70%乙醇、10mg/mL溴化乙锭（EB)、Tris-乙酸电泳缓冲1 SN/T 2022—2007液(TAE)、1.5%琼脂糖凝胶、6×加样缓冲液、3.8%柠檬酸钠、1.5%乙二胺四乙酸二钠(EDTA二钠)的配制见附录A。除另有规定，所用化学试剂均为分析纯。3.4引物引物序列见表1。引物用灭菌三蒸水配成100umol/L母液，一20℃冻存。使用时用灭菌三蒸水配成5 μmol/L 的工作液。表 1试验所用引物序列引物引物位置产物大小/bp核苷酸序列引物浓度/（μmol/L）106-132,27bpmwFaacg-3.5(AY946266)738826-843,18bpmwR3b 5-agcactcgactagatgtc-35(AY946266)a 上游引物 forward primer。b 下游引物 reverse primer。4操作步骤4.1样品采集无菌采牛血，用3.8%柠檬酸钠或1.5%EDTA二钠抗凝作为临床检测样品。4.2样品处理400 μL抗凝血加10 μL溶菌酶(50mg/mL)涡旋混匀,37℃下温育1h;加人70μL10%SDS,6μL蛋白酶K(10 mg/mL),65℃下温育10 min;加人100 μL 5 mol/L氯化钠,160 μL CTAB,65℃下温育10 min;加入等体积的苯酚-三氯甲烷-异戊醇抽提，常温下12 000×g离心10 min;取上清液，再次加人等体积的苯酚-三氯甲烷-异戊醇抽提，常温下12 000×g离心10 min;取上清液，加人两倍体积的无水乙醇和1/10体积的2mol/L的乙酸钠，一20℃沉淀30min，13000×g4℃离心10min;弃上清液，沉淀用冷70%乙醇洗一次，自然干燥;用20 uL的三蒸水溶解，一20℃保存备用。4.3 PCR4.3.1对照设立-阳性对照用E.wenyoni16S rRNA部分序列连接在PMD18-T载体上构建的重组质粒；一阴性对照用健康牛抗凝血提取的DNA作为对照；一空白对照用灭菌三蒸水。4.3.2 PCR 反应体系总体积30μL,10×PCR反应缓冲液3μL;氯化镁（MgCl²)3μL;dNTP3μL;引物mwF 和mwR3各1μL;阳性对照(10 ng～20 ngDNA)或样品 1μL;0.2μL TaqDNA 聚合酶,18 μL三蒸水。4.3.3循环参数PCR 反应循环参数为 94℃ 3 min