SN_T 2713-2010贝类马尔太虫检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2713-—2010贝类马尔太虫检疫技术规范Quarantine protocol for Marteilia refringens in shellfish2010-11-01 发布2011-05-01实施中华人民共·和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准贝类马尔太虫检疫技术规范SN/T 2713—2010*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. spc. net. cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230　1/16　印张 11字数 24千字2011年3月第一版反　2011年3月第一次印刷印数1—1 600*书号：155066·2-21649 SN/T 2713—2010前 言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准非等效采用了国际动物卫生组织（OIE)《水生动物疾病诊断手册》(2009版)中2.4.4等有关章节。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：岳志芹、方绍庆、邓明俊、孔繁德、吴绍强、赵玉然、郑小龙、梁成珠、徐淑菲、徐彪、朱来华、肖西志。- SN/T 2713--2010贝类马尔太虫检疫技术规范范围1本标准规定了折光马尔太虫的检疫技术规范。本标准适用于折光马尔太虫的分离和鉴定,也适用于该病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3设备和材料3.1设备3.1.1普通光学显微镜。3.1.2组织研磨器。3.1.3切片机。3.1.4 PCR 仪。3.1.5凝胶成像仪或紫外观察灯。3.2 材料3.2.1水：组织切片时用的水为75%的盐水。做 PCR时所用的水要用超纯水。用水符合GB/T 6682规定。3.2.2干净的盖玻片、载玻片（若干）。涂有氨基烷基硅烷(aminoalkylsilane)粘附剂的载玻片。3.2.3染色剂：常规涂片及组织学染色剂（见附录A）。3.2.4酚-三氯甲烷抽提法方法或其他DNA抽提试剂盒提取组织 DNA（见附录 A）。.6蛋白酶K。3.2.7硫酸镁（MgSO4）。3.2.8dNTP。3.2.9Taq DNA聚合酶及 PCR缓冲液。DNA DL2000 Marker.3. 2. 103.2.11核酸染料-EB(或者新型替代染料如:GENEFINDER）。3.2.12俾斯麦棕(bismarck brown yellow)染液。3.2. 13电泳缓冲液（见附录A)。3.2.14引物Pr4 : 5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3Pr5 : 5-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3 SN/T 2713—2010SS2 : 5-CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG-3SAS2 :5-CGA-ACG-CAA-ATT-GCG-CAG-GG-33.2.15Davidsons 固定液（见附录 A）。3.2.1620XSSC缓冲液（见附录 A）。3.2.1750XDenhardts 溶液(见附录 A)。3.2.18PCR产物纯化试剂盒。3.2. 19地高辛标记试剂盒。4采样(以牡蛎为例其他贝类参照此法）4.1临床采样挑选至少10只死的或带有疑似临床症状的活牡蛎个体（2年龄），在活体或刚死后分别包装放在密封冷藏的容器中送至实验室。所采集的牡蛎应严格避免冰冻，4℃条件下不宜超过24 h，感染早期的个体一般取其唇的触须和胃；严重感染的个体除取上述的部位外，主要采集消化腺管道及其粪便。4.2监测采样4.2.1通用要求当个体怀卵时，,应每年在产卵期来集二次卵液。对无临床症状的牡蛎：取其唇的触须和胃、消化道上皮及粪便；成熟雌蛎还需取其卵巢液。样品应包括该地所有的易感品种（参见附录B)。4.2.2监测初期的采样要求在2 年内每年对该养殖场监测 2欧。监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能观察到该虫的温度和季节，通常为水温高于17的夏季和秋季。每次采样的牡蛎数量按感染率等于或大于2%时检出的概率进行抽样。整体情况下,每次采集150/个个体,对怀卵的个体,两次检查中至少有一次要在亲牡蛎中取150份卵巢液样品。采集150个（可能优先采取幼龄期、老龄及和（或）对野生、混养的蛎群，至少两年内每年个亿雌性卵巢液。4.2.3监测保持期采样的要求