SNT 2344-2009黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法Quarantine identification of cucumber green mottle mosaic virus2010-01-16实施2009-07-07发布中华人民共和国发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法SN/T 2344—2009中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*印张 0.75字数 17千字开本880×12301/162009年10月第一次印刷2009年10月第一版印数 1—2 000*书号：155066·2-19950 SN/T 2344—2009前言本标准的附录 B、附录 C为规范性附录,附录 A、附录 D为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广西出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈青、邓丛良、张永江、廖富荣、林石明、陈红运、王宏毅、李伟丰、李树庆。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2344—2009黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能带有黄瓜绿斑驳花叶病毒的葫芦科作物的种子和苗木的检疫鉴定。2原理2.1黄瓜绿斑驳花叶病毒学名与分类地位学名:Cucumber green mottle mosaic virus缩写:CGMMV分类地位：烟草花叶病毒属（Tobamovirus)成员2.2 血清学特性CGMMV具有很强的免疫原性。2.3粒体形态黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体为直杆状，长度为300:nm，宽为18.nm2.4 基因组病毒基因组为正单链 RNA,全长约.6.4. kb,编码:4.个蛋白;病毒基因组 5和3端分别含有一段非编码区。该病毒寄主范围广泛、危害严重,相关资料参见附录 A。3主要仪器设备与试剂3.1主要仪器设备和用具微量研磨仪；透射电子显微镜；-酶标仪；-洗板机；微量天平（感量：0.001）-PCR 仪;电泳仪；-水平电泳槽;；凝胶成像仪；高速冷冻台式离心机；水浴槽；pH计;各种量程的可调移液器（1000 μL、200μL、20.μL、2μL）;各种吸头(1 000 μL、200 μL、20 μL、2 μL);-96孔酶标板；离心管(1.5 mL、0.6 mL、0.2 mL)。3.2 主要试剂主要试剂和缓冲液见附录 B和附录 C。 SN/T 2344—20094检测样品的制备4.1种子样品制备及检疫鉴定挑取 500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中,待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组)并编号，采集的叶片分成3份，根据需要分别用于酶联测定免疫和分子生物学检测及电子显微镜观察。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。4.2苗木检验鉴定有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测,分组方法和检测方法同 4.1。4.3植物产品的检验鉴定植物产品有症状的部分(如：果实上的畸形、斑驳等)单独检测。没有症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测。5 检测与鉴定5.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加入已包被CGMMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。设阴性对照和阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照,其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片)应尽量与检测样品一致。具体操作见附录 B。5.2 RT-PCR 检测分别提取样品和对照的总 RNA，反转录合成cDNA后，进行 PCR扩增。设阴性对照，感染 CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。5.3免疫电子显微镜观察具体操作参见附录D。6结果判定与记录第5章检测与鉴定中如果2种方法检测为结果为阳性，即可判断该批种苗携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。酶联测定为阳性后,RT-PCR检测为阳性即可判断为携带有黄瓜绿斑驳花叶病毒。必要时可进行生物接种试验，并进行复验。结果记录与样品保存77.1结果记录完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。电镜观察需有病毒粒体照片；酶联测定需有酶联板反应的照片和原始数据;PCR检测需有电泳结果照片。7.2样品保存鉴于黄瓜绿斑驳花叶病毒为检疫性有害生物，病毒要有活体样品存在，其他实验样品应妥善