WST 54-1996尿中苯乙醛酸和苯乙醇酸的高效液相色谱测定方法.pdf

中华人民共和国卫生行业标准尿中苯乙醛酸和苯乙醇酸的WS/T 54-1996高效液相色谱测定方法Urine--Determination of phenylglyoxylic acidand mandelic acid--High performance liquidchromatographic method1主题内容与适用范围本标准规定了尿中苯乙醛酸和苯乙醇酸的高效液相色谱测定方法。本法最低检测浓度为苯乙醛酸1mg/L，苯乙醇酸10mg/L。本标准适用于接触苯乙烯或乙苯的工人尿中苯乙醛酸和苯乙醇酸的测定。2原理尿样加盐酸酸化后，用二氯甲烷与异丙醇的混合溶剂萃取，浓缩进样后，由高效液相反相C18柱分离，紫外检测器于波长225、254nm处检测。用保留时间定性，内标法峰面积比定量。3仪器3.1高效液相色谱仪，可变波长紫外检测器。3.2离心机，3.000r/min。3.3旋涡混合器。3.4真空抽滤装置。3.5试管,15mmX100mm。3.6具塞离心管，5mL。3.7容量瓶,50mL。3.8微量注射器，10μL、50μL。3.9聚乙烯瓶，150mL。3. 10尿比重计。4试剂本标准所用试剂除另有说明者外，均为分析纯级。4.1实验用水：重蒸水。4.2盐酸，p=1.19g/mL。4.3 磷酸,85%(m/m)。4.4冰乙酸，p=1.05g/mL。4.5二氯甲烷。4.6异丙醇。1997-05-01实施中华人民共和国卫生部1996-10-14批准 WS/T 54--19964.7甲醇。4.8苯乙醛酸(PGA)。4.9苯乙醇酸(MA)。4.10 马尿酸(HA)。4.114-羟基苯甲酸。4.12混合萃取溶剂：二氯甲烷十异丙醇，9十1。4.13流动相（混合酸水溶液）：取冰乙酸、85%磷酸各1.0mL稀释至100mL置冰箱存放，用时取10mL用水稀至1L，为0.1%混合酸水溶液，4.14准确称取PGA0.2000g，MA0.5000g，HA0.1000g，用1mL0.5mol/LNaOH溶解后，用水稀释至50mL为标准贮备液。此溶液1mL相当于4.0mgPGA，10.0mgMA2.0mgHA。临用时用水稀释10倍，为标准应用液。此溶液1mL相当于0.4mgPGA，1.0mgMA，0.2mgHA。4.15内标溶液：准确称取0.2000g4-羟基苯甲酸，用1mL0.5mol/LNaOH溶解，用水稀释至50mL.4.16质控样：用加标的模拟尿、接触者混合尿或加标的正常人混合尿作质控样。5采样、运输和保存用聚乙烯瓶收集接触苯乙烯工人班后尿80～100mL，在低于10℃下运输，测比重。于4℃冰箱可保存一周，于一20℃冰箱可保存二周。6分析步骤6.1仪器操作条件色谱柱：柱长15cm，内径4mm，不锈钢柱。柱填料：C键合固定相，10um。柱温：室温。流动相：甲醇+混合酸水溶液=15十85(V/V)（4.13）。流速：1.0mL/min。检测器波长：225nm，254nm。6.2空白试验取1mL非接触者混合尿与样品同时进行测定。6.3样品处理6.3.1取1.0mL尿样于小试管(3.5)中。6.3.2加0.1mL6mol/L盐酸，用微量注射器加50uL内标溶液（4.15），以4.0mL混合萃取溶剂（4.12)在旋涡混合器上萃取1min。离心10min，用真空泵将上层尿液抽尽，转移0.5mL有机相至离心管（3.6)中，在40℃水浴中用氮气将有机溶剂吹干。加0.2mL流动相溶解残留物，取5μL进HPLC。6.4标准曲线绘制6.4.1取6支小试管（3.5），按表1配制标准管。 WS/T 54--1996表1PGA和MA标准管的配制管号01235标准应用液（4.14），mL00. 10. 30. 50.71.0水,mL1. 00. 90.70. 50. 30PGA含量，mg00.040.120.2 .0.280. 40MA含量,mg0.10. 30. 50. 71. 06.4.2按6.3.2条操作。6.4.3重复进样三次。以被测物含量为横坐标，被测物与内标物峰面积比平均值为纵坐标，绘制标准曲线。6.5样品测定6.5.1在上述操作条件下（6.1），取5μL样品溶液（6.3.2)进HPLC。同时测定空白样品溶液（6.2）。用保留时间定性，用被测物与内标的峰面积比值在标准曲线上查出被测物的浓度。色谱图见下图。108013ese3VAHO-tVH74.451C12VW3.9821015minPGA，MA，HA，4-OHBA的色谱分离图在测定前后及每分析10个样品后分析一个质控样。7 计算7.1按式(1)计算尿样换算成标准比重(1.020)下的浓度校正系数(k）。1.020 -1.000k=(1)实测比重=1.0007.2按式(2)计算尿中苯乙醛酸和苯7.酸的浓度。X=c·k.