SN_T 3284-2012可可花瘿病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3284—2012可可花瘿病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Albonectria rigidiuscula2013-05-01 实施2012-10-23 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3284--2012前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国海南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘福秀、韩玉春、李伟东、林明光、徐卫。一 SN/T 3284—2012可可花瘘病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了可可花瘦病菌的检疫和鉴定方法本标准适用于可可属植物及其产品中可可花瘦病菌的检疫和鉴定。2 病菌基本信息可可花瘿病菌属菌物界（Fungi）、子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、丛赤壳科（Nectriaceae）、丛白壳属（Albonectria）。该病菌主要通过伤口侵人寄主，侵染来源一是带病种苗，二是病株的残枝落叶，病菌在病组织或土壤中可存活3年～5 年。病菌通过土壤、繁殖材料(种子及营养繁殖材料)传播。3原理根据可可花瘿病菌的形态特征、培养性状、所致病害的症状特点和寄主范围（参见附录 A和附录B)，采用病原菌的分离及致病性测定的方法进行检测和鉴定。4试剂与培养基4.1试剂琼脂粉、马铃薯、葡萄糖。孔雀绿、吐温-20、次氯酸钠、酒精。4.2培养基病菌分离和纯化采用PDA培养基。5仪器和用具生物显微镜（带有照相装置和测微尺）、体视显微镜、天平（感量0.1g）、冰箱（4℃士2℃；一80℃）、超净工作台、高压灭菌锅、光照培养箱、磁力搅拌器。血球计数板、注射器、手术刀、手术剪、镊子、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、培养血、试管（20 mL）、三角瓶（250 mL）、烧杯（1000mL）、酒精灯、封口膜、吸水纸、脱脂棉。6检测与鉴定6.1现场检疫仔细检查,观察典型症状或可疑症状(参见附录 A)和土壤等。感病组织表面可能有花瘦、肿瘤或1 SN/T 3284—2012枯梢。发现可疑植株或土壤，切取受害部位或将整棵植株或土壤取回实验室检验。6.2、室内检测与鉴定6.2.1保湿培养在超净工作台上将灭菌的滤纸放人灭菌的培养皿中，加人无菌水直至滤纸完全湿润备用。用自来水将病组织冲洗干净，在超净工作台上用吸水纸吸干表面水分。将样品放人上述装有湿滤纸培养Ⅲ中，用封口膜封好培养皿，30℃士1℃培养1d～3d。6.2.2病原菌分离病组织中病原菌的分离将灭菌PDA培养基制成PDA平板和斜面备川。在超净工作台上将病组织切成小块，放人70%酒精10s,后移人0.5%次氯酸钠溶液1min。用无菌水冲洗3遍，再用灭菌的干滤纸吸干表面汞分。将样品放入PDA平板，在30℃±1℃下，12h黑暗培养14d。如发现可疑的菌落应该及府使用PDA培养基进一步纯化培养观察.并进行后续实验。分离出来的病原物产孢后，采角单孢分离法进一步纯化。将分生孢子制成浓度为100 CFU/ml.的孢子悬浮液。先在PDA平板背面用记号笔画上一些直径约3mm左右的圆圈作为标记，在超净工作台上向标记好的圆圈中加人1μL的孢子悬浮液。用封口膜封好PDA平板，30℃±1℃培养24h。在低倍显微镜（100×）下观察标记的圆圈将含单个孢子的圆圈处的培养基移到新的PDA平板中。分离纯化的病原菌转到PDA斜面上4℃保存。根围介质中病原菌的分离样品充分混匀后，取0.5g加5ml无菌尔.在磁力搅拌器上搅拌30min，自然沉淀5min后，取上清液100μl，涂布含12.8μg/ml孔雀绿的功)A培养基平板；30℃土1℃下，按的方法培养并纯化。6.2.3菌落及孢子形态观察菌落形态和颜色、大型分生孢子形态和大小是鉴定可可花瘦病菌的重要指标。保湿培养后取病组织上的子实体直接镜检，观察大型分生孢子的形态。从单孢分离物的菌落边缘取一天小为.5-mm×5mml的菌丝块置于新的PDA平板中央，在30℃±1℃下，12h光照/黑暗培养。每隔24h观察记录菌落颜色、形状、边缘特征及菌落质地情况，直至菌丝长至平板边缘。于高倍显微镜（400×）下随机测量大型和小型分生孢子各30个，取测量值的平均值。大型分生孢子镰刀形或稍弯的柱形，透明，通常有 5～9个隔，大小为（68.5μm～97.5μm）×（7.5 μm～9.2μm），比同属的其余种类都大（参见图 B.2,图 B.3）。子囊壳散生或聚生，卵形或球形，（0.27mm～0.6 mm）×（0.16 mm～0.4mm），具4个子囊孢子。极少数2～8个。子囊孢子纺锤形、稍弯曲、两端钝圆锥形，具不明显条纹，（19 μm～29 μm）×（5